Коллектив авторов - Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии

Химические тесты основаны на определении содержания кальция в декальцинирующей жидкости. Кальций-оксалатный методпозволяет обнаруживать в ней кальций за счет преципитации нерастворимых гидроокиси и оксалата кальция. Берут 3 мл использованной декальцинирующей жидкости, опускают в нее маленький кусочек лакмусовой бумаги и добавляют по каплям концентрированный (25 %) водный раствор аммиака до тех пор, пока раствор не станет нейтральным (взбалтывают после добавления каждой капли). Затем добавляют примерно 5 мл насыщенного при комнатной температуре раствора оксалата аммония, хорошо взбалтывают и оставляют на 30 мин. Образование преципитата свидетельствует о том, что в декальцинирующей жидкости имеется значительное количество кальция. Если исследуемая жидкость остается прозрачной в течение 30 мин, то декальцинация завершена.

1. Некачалов В. В. Патология костей и суставов. – СПб.: Сотис, 2000. – 285 с.

2. Merchan-Perez A., Gilloyzaga P., Bartolome M. V. [et al.]. Decalcification by ascorbic acid for immuno- and affinohistochemical techniques on the inner ear // Histochem. Cell Biol. – 1999. – Vol. 112. – P. 125 – 130.

Обезвоживание фиксированных объектов обязательно предшествует их заливке в парафин. Из фиксированных объектов можно готовить срезы и без заливки при помощи замораживающего микротома (замораживающего столика) и вибратома.

Перед обезвоживанием материала производят подготовку фиксированных кусочков органов и тканей для гистологического исследования (вырезку). Вырезанные кусочки должны иметь толщину не более 0,8 см (оптимально – 0,3 – 0,5 см), длину и ширину в пределах 1,5 – 2,0 см, т. е. не более длины сторон стандартного покровного стекла. При использовании для проводки гистологических кассет размеры кусочка ткани ограничиваются размерами кассеты. Не рекомендуется изготавливать слишком крупные кусочки, так как если они будут плотно прилегать к стенкам кассеты, то пропитка материала растворами в этом месте будет плохая. Также не рекомендуется складывать несколько кусочков тканей в одну кассету, поскольку они могут слипнуться и плохо пропитаться.

Перед проводкой материала кусочки органов и тканей, которые были фиксированы в формалине, промывают в проточной воде (до 24 ч) и подсушивают на фильтровальной бумаге.

Для обезвоживания материала обычно используют несколько порций этилового спирта восходящей крепости. Для материала, фиксированного в формалине, рекомендуется начинать с 70 – 80 %-го этанола, в котором объекты могут находиться длительное время без существенного сжатия и изменения тинкториальных свойств. Кроме этанола для обезвоживания может быть применен безводный ацетон, изопропанол, диоксан, глицерин. Обезвоживание ускоряется при постоянном перемешивании жидкости, которое обеспечивают автоматизированные системы проводки карусельного типа (Sakura Rotary Tissue Processor, Leica TP1020, Microm STP 120, АТ-5).

Продолжительность пребывания объектов в спирте обусловлена их размерами, свойствами тканей и особыми задачами исследования (например, необходимостью максимального удаления липоидов из нервной ткани перед заливкой в целлоидин и окраской по Нисслю).

Для обезвоживания кусочков обычного размера (1,0 – 2,0 × × 1,0 – 1,5 × 0,5 – 0,8 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки (при комнатной температуре без постоянного перемешивания).

Первая схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– этанол абсолютный – 6 – 24 ч.

Вторая схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 18 – 24 ч.

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 18 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 18 – 24 ч;

– метилсалицилат (или метилбензоат) – этанол 96 %-й (1: 1) – 2 ч;

– метилсалицилат (или метилбензоат) – 12 – 24 ч.

В метилсалицилате материал можно долго хранить без ухудшения качества препаратов (Коржевский Д. Э., 1996; Коржевский Д. Э. [и др.], 2008). Так как проводка через метилсалицилат и метилбензоат приводит к смягчению плотных объектов, ее полезно использовать при обработке кусочков кожи и органов, содержащих много мышечной и соединительной ткани.

Ускорения процесса обезвоживания можно добиться, вырезая кусочки тканей меньшего размера (например, 1,0 × 0,5 × 0,2 см), обеспечивая постоянное перемешивание растворов (например, в автоматизированной системе гистологической проводки) и проводя обезвоживание при 37 °C в термостате. Большее повышение температуры растворов не рекомендуется в связи с опасностью сжатия и чрезмерного уплотнения тканей. Плотные объекты (кожа, декальцинированная кость) не следует обезвоживать при повышенной температуре.

Для обезвоживания маленьких кусочков (размерами до 1,0 × 0,5 × 0,3 см) можно рекомендовать следующие схемы ручной проводки.

Первая схема:

– этанол 80 %-й – 6 – 8 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 12 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 4 – 24 ч;

– этанол абсолютный – 2 – 4 ч (при комнатной температуре).

Вторая схема:

– этанол 80 %-й – 6 – 8 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 12 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 6 – 24 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 3 – 5 ч (при комнатной температуре).

Третья схема:

– этанол 80 %-й – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (I) – 6 – 18 ч;

– этанол 96 %-й (II) – 2 – 4 ч;

– этанол 96 %-й (III) – 2 – 4 ч (при температуре 37 °C).

Высокое качество обезвоживания может быть достигнуто только при использовании этанола соответствующей крепости. Поэтому качество спирта необходимо проверять с помощью ареометра. Абсолютный спирт пригоден для обезвоживания (в качестве абсолютного спирта), если его крепость не ниже 98 %. Объем обезвоживающего раствора должен не менее чем в 10 раз превышать объем погруженных в него обезвоживаемых объектов. Абсолютный этанол можно заменить абсолютированным изопропанолом (99 %). Пригодна для этого и смесь абсолютированного изопропанола и этанола 96 %-го (1: 1).

Получение тонких срезов образцов исследуемых тканей возможно только после пропитывания последних достаточно плотными средами, какими являются парафин и целлоидин. В настоящее время целлоидин применяется очень редко.

Парафин– смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, получаемая при перегонке нефти. Сорта парафина, используемые в качестве среды для гистологической заливки, имеют температуру плавления от 48 до 60 °C. Наиболее удобен в повседневной работе парафин с температурой плавления 52 – 56 °C. Без дополнительной подготовки технический, пищевой и медицинский парафины не позволяют производить заливку, обеспечивающую высокое качество срезов. В гистологической лаборатории желательно использовать очищенные сорта парафина с добавлением восков или специально разработанные на основе парафина среды с модифицирующими добавками, такие как гистомикс («БиоВитрум», Россия), Paraplast (Sigma, США), Histoplast (Shandon, США).