Ирина Спивак - Экология. Повреждение и репарация ДНК: учебное пособие

На рисунке 5б видно, что АР-сайт характеризуется вывернутой позицией сахарного остатка, взаимодействующего с аспаргином 238. Лейцин-170 взаимодействует с другой нитью ДНК. HhH работает якорем ДНК на белке.

Несмотря на столь высокое функциональное сходство гликозилаз и их присутствие практически у всех организмов, поиск среди них генов-гомологов пока нельзя признать успешным. Четкая эволюционная линия гомологов найдена только для урацил-ДНК-гликозилазы – гены ung, UNG и hUDG в клетках Е. coli, S. cerevisiae и человека соответственно. Индуцибельная полифункциональная гликозилаза AlkA из Е. сoli (cхема строения которой приведена на рис. 5), репарирующая различные продукты метилирования оснований, оказалась гомологична N-гликозилазе MAG из S. cerevisiae и аналогична гликозилазе MPG из клеток человека. А в клетках S. сerevisiae недавно обнаружен гомолог формамидопиридин-ДНК-гликозилазы Fpg из Е. coli.

Схема процесса BER представлена на рис. 6. После распознавания повреждения гликозилазами и внесения разрыва в сахарофосфатный остов у E.coli в работу вступает еще один фермент – фосфодиэстераза, который отщепляет от ДНК ту сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. Появляется брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бреши в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид, и следующий фермент – ДНК полимераза I вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид, присоединяя его к свободному З'ОН-концу. Чтобы соединить два свободных конца (З'ОН-конец вставленного нуклеотида и 5'-конец, ранее образовавшийся при разрыве нити ДНК АР-эндонукдеазой), вступает в действие еще один фермент – полинуклеотидлигаза. У человека это соответственно ДНК-полимераза β и лигирующий комплекс лигаза III/белок XRCC1. N-концевой участок этого белка взаимодействует с ДНК-полимеразой β, а С-концевой участок – с ДНК-лигазой III, выполняя структурную функцию. Это один из двух путей BER, при котором брешь в ДНК не превышает 1 нуклеотида. Этот путь носит названия репарации коротткими фрагментами (short path repair). Но есть и другой путь, при котором выщепляется 2-13 нуклеотидов и он носит название репарации длинными фрагментами (long path repair). В этом случае репаративеый синтез ДНК (начиная со второго нуклеотида) осуществляется полимеразами δ или ε, функционирование которых зависит от факторов пролиферации PCNA (proliferaiting сell nuclear antigene) и репликации RFC (replication factor C). Образовавшийся 3’-конец служит мишенью для привлечения RFC, который в свою очередь помогает PCNA связаться с ДНК.

Во время этого синтеза участок цепи ДНК, ранее спаренный с тем, который служит матрицей для синтеза, вытесняется, образуя свободно свешивающийся фрагмент ДНК – flap. Затем его удаляет специальная эндонуклеаза – ДНКаза IV у прокариот или FENI (flap endonuclease I) у эукариот. В настоящее время показано, что FENI, как и процессивные полимеразы, связана с PCNA, который ее активирует.

Рисунок 6. Схема процесса BER.

Лигирование, то есть восстановление фосфодиэфирной связи осуществляется ДНК-лигазами I и III, причем ДНК-лигаза I взаимодействует с PCNA и polδ и принимает участие преимущественно в репарации «длинными фрагментами». ДНК-лигаза III взаимодействует с XRCC1, polβ и PARP1 (polyadenosylribose polymerase I) и участвует в репарации «короткими фрагментами».

Теперь вся структура ДНК полностью восстановлена: неправильное основание удалено, сахарофосфат, к которому это основание было прикреплено, вырезан из нити ДНК, брешь заполнена правильным(и) нуклеотидом(ами), и все однонитевые разрывы залечены. Поскольку последовательность реакций запущена в действие путем расщепления гликозильной связи, этот вид репарации получил название еще одно название – "вырезание оснований с помощью гликозилаз".

До сих пор дискутируется вопрос о том, от чего зависит, по какому пути репарации – «короткими или длинными фрагментами» пойдет BER. Долгое время считалось, что «нормальные» АP-сайты репарируются по первому пути, а модифицированные (окисленные или восстановленные) – по второму. Современный взгляд несколько изменился. Было показано, что вставка первого нуклеотида не зависит от типа АP-сайта, причем в этой реакции главную роль играет ДНК-порлимераза-β. Во время репарации «короткими фрагментами» именно она вставляет один нуклеотид вместо вырезанного. Эта же полимераза вставляет первый нуклеотид в процессе репарации «длинными фрагментами».

Выбор между репарацией длинными или короткими фрагментами зависит от того, способна ли в данном конкретном случае ДНК-порлимераза-β проявить свою лиазную активность. А это как раз зависит от того, каким является АP-сайт. Если он окислен или расщеплен химически, то оказывается устойчивым к β-элиминации с помощью ДНК-полимеразы-β. В этом случае она после вставки первого нуклеотида диссоциирует от ДНК, и дальше сценарий идет по модели репарации «длинными фрагментами» с вовлечением PCNA-зависимых полимераз. Таким путем репарируется около 25 % повреждений. Но, к примеру, удаление 8-оксигуанина происходит преимущественно путем репарации «короткими фрагментами».

К настоящему времени у человека генетические заболевания, сопряженные с нарушением системы BER, не найдены. Но было обнаружена зависимость активности этой системы репарации от белка Р53. Этот антионкоген стимулирует BER путем прямого взаимодействия с АРЕ1 и ДНК-полимеразой-β, стабилизируя связывание последней с АР-сайтом. Данные об активации при этом транскрипции самого Р53 противоречивы, хотя показано, что после воздействия на мышей алкилирующим агентом нитропропаном наблюдалась активация транскрипциии Р53 и polβ, при одновременном повышении эффективности эксцизионной репарации оснований.

В целом, BER – чрезвычайно действенный барьер мутациям оснований. Ярким примером этого является тройная система защиты ДНК от окисления гуанинов, выявленная как у Е. сoli, так и у высших эукариот, включая человека.

Известно, что окислению может подвергаться не только уже встроенные в цепь ДНК нуклеотиды, но и их предшественники. Окисление dGTP приводит к образованию 8-окси-dСТР, но клетка содержит специализированную dGTPaзy – белок MutT, обладающий повышенным сродством к 8-окси-dGTP. Этот белок гидролизует 8-окси-dGTP до 8-окси-dGMP, удаляя его из пула нуклеотидов и предотвращая его встраивание во вновь синтезируемую ДНК. Таким образом MutT E.coli и МТН1 (Mut T homologue 1) человека являются крайне интересными белками, не вовлеченных напрямую в эксцизионную репарацию оснований, но существенно снижающими уровень оксипуринов в ДНК.