Коллектив авторов - Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии

Коагулирующие фиксаторы (спирты и различные спиртовые композиции) дают лучшие результаты при фиксации белков и гликопротеидов с большой молекулярной массой. Так, оптимальной фиксацией для определения виментина является жидкость Карнуа (один из коагулирующих фиксаторов). При фиксации нервной ткани предпочтительна непродолжительная (до 24 ч) фиксация в цинк-этанол-формальдегиде (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006а), который не только хорошо сохраняет многие антигены, но и дает возможность получить отличные результаты при окраске по Нисслю. Для фиксации небольших пептидов (инсулина и др.), малых молекул и гаптенов (например, моноаминов) рекомендуется использовать альдегидные фиксаторы, поскольку в коагулирующих фиксирующих средах возможно частичное растворение либо диффузия низкомолекулярных антигенов.

После окончания фиксации остатки фиксирующих веществ необходимо удалить из материала, тщательно промыв его в дистиллированной воде (после формалина и цинк-формалина) или этаноле (после коагулирующих фиксаторов и спиртовых смесей). Заливка должна быть осуществлена в течение 2 – 5 сут после завершения фиксации. Это обеспечивает максимальную сохранность антигенов и их хорошую выявляемость в препаратах. При использовании архивного материала, длительно фиксировавшегося в формальдегидных фиксаторах либо хранившегося в 80 % этаноле, тепловое демаскирование следует проводить обязательно для всех типов антигенов, которые при этом не подвергаются разрушению, и использовать вторичные системы детекции высокой чувствительности.

Степень «жесткости» альдегидной фиксации и пригодность архивного материала для ИГХ-исследования удобно контролировать, используя тест-реакцию с моноклональными антителами к виметину (клон V9). Антитела клона V9 выявляют чувствительный к перефиксации эпитоп этого белка ПФ. Поскольку клетки, содержащие виментин (фибробласты, эндотелиоциты, менингоциты и др.), присутствуют в любом гистологическом объекте, за редким исключением, отрицательные результаты пробной ИГХ-реакции на виментин будут указывать на малую пригодность материала для ИГХ в целом. При обезвоживании материала не следует применять изопропанол, который делает объекты хрупкими и плохо поддающимися резке на микротоме. В качестве промежуточных сред могут быть использованы: хлороформ, петролейный эфир, ортоксилол, метилсалицилат, метилбензоат, неоптическое кедровое масло, пихтовое масло, терпинеол. Заливку можно проводить, используя парафин любых коммерческих марок, лучше известных производителей, как отечественных, так и зарубежных. При этом не следует применять парафин с высокой температурой плавления (58 – 60 °C). При заливке не рекомендуется использовать температуры выше 60 °C.

Заливка в целлоидин и целлоидин-парафин нежелательна, так как приводит к развитию неспецифической фоновой окраски в ходе выявления пероксидазы диаминобензидином. В случае необходимости применения целлоидина перед постановкой реакций его следует удалить из срезов жидкостью Никифорова (спирт-эфиром).

Изготовление срезов для ИГХ-исследования следует проводить на надежных ротационных и санных микротомах, обеспечивающих точную подачу и необходимый диапазон толщины срезов (3 – 7 мкм). Более толстые срезы могут потребовать модификации протоколов ИГХ-обработки и изменения времени демаскирования антигенов. Кроме того, толстые срезы плохо удерживаются на предметных стеклах даже при использовании специальных адгезивов. Срезы должны быть хорошо расправлены. Отсутствие складок позволяет обеспечить лучшее прилипание к предметному стеклу.

Для того чтобы избежать неспецифической фоновой реакции при наклейке срезов на предметные стекла, не следует использовать в качестве адгезивов яичный альбумин и сыворотку крови. Обычно расправленные на дистиллированной воде срезы толщиной до 5 мкм хорошо приклеиваются к ничем не обработанным предметным стеклам импортного производства (например, к стеклам фирм «Shandon» (США) и «Menzel» (Германия) ). При необходимости обычные предметные стекла для улучшения прилипания срезов могут быть обработаны специальными адгезивами (см. Приложение 2).

При расправлении и сушке срезов нежелательно применять высокие температуры (выше 48 °C). Оптимальным является просушивание срезов в суховоздушном термостате с вентиляцией при 40 °C в течение 3 дней. Более продолжительное пребывание срезов в термостате может способствовать лучшему их приклеиванию к предметным стеклам. При необходимости работы с препаратами на следующий день после изготовления срезов желательно использовать стекла с адгезивным покрытием, нанесенным в заводских условиях.

Потеря срезов во время проведения теплового демаскирования и длительной инкубации с антителами, когда нельзя изготовить новые срезы (весь блок уже порезан), ставит вопрос о принципиальной возможности улучшения прилипания срезов к предметному стеклу на этапе, когда срезы уже находятся на нем. Эту проблему можно попытаться решить, прогревая предметные стекла со срезами в течение ночи (перед проведением ИГХ-реакции) в термостате при 60 – 65 °C. При использовании такого способа достигаемое иногда улучшение приклеивания срезов сопровождается некоторой потерей иммунореактивности, вызванной действием на срезы высокой температуры.

Удаление парафина из срезов и их регидратацию перед иммуногистохимическим исследованием проводят так же, как и перед обычной окраской. При этом следует проверять спирты на загрязнение ксилолом, поскольку остатки ксилола, как и плохо удаленный парафин, могут приводить к понижению чувствительности реакции. Заменители ксилола следует использовать с осторожностью, поскольку они медленнее отмываются в спиртах и быстрее загрязняют их, чем ксилол.

Коржевский Д. Э . Использование моноклональных антител к ядерному белку PCNA для выявления пролиферирующих клеток в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2000. – Т. 118, № 5. – С. 68 – 70.

Коржевский Д. Э . Макрофаги сосудистого сплетения конечного мозга эмбриона человека // Морфология. – 2001. – Т. 119, № 1. – С. 20 – 23.

Коржевский Д. Э., Гилерович Е. Г., Зинькова Н. Н . [и др.]. Иммуногистохимическое выявление нейронов головного мозга с помощью селективного маркера NeuN // Морфология. – 2005. – Т. 128, № 5. – С. 76 – 78.

Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006а. – Т. 129, № 1. – С. 85 – 86.

Коржевский Д. Э., Отеллин В. А. Морфологические основы формирования гематоликворного барьера сосудистого сплетения головного мозга в пренатальном онтогенезе человека // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. – 2001. – Т. 37, № 2. – С. 150 – 153.