Коллектив авторов - Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии

Коржевский Д. Э., Отеллин В. А., Неокесарийский А. А. [и др.]. Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. – 2006б. – Т. 129, № 3. – С. 63 – 64.

Коржевский Д. Э., Талантова О. Е., Павлова Н. Г. Экспрессия белка bcl-2 в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2002. – Т. 122, № 5. – С. 31 – 34.

В процессе фиксации тканевые антигены претерпевают конформационные изменения, связанные с коагуляцией белков и образованием перекрестных сшивок при воздействии альдегидов (формальдегида и глутарового альдегида) (Fraenkel-Conrat H. [et al.], 1947; 1948). Эти изменения во многих случаях приводят к маскировке антигенных детерминант, с которыми должны взаимодействовать полученные антитела к данным белкам. В результате оказывается, что при постановке иммуногистохимических реакций на фиксированном материале часть антител проявляет недостаточно высокую активность и окрашивание конечного продукта реакции слишком слабое либо вообще отсутствует. Степень повреждения антигенов зависит от условий фиксации и концентрации альдегидов в фиксирующей жидкости. Считается, что коагулирующие фиксаторы (спирты, уксусная кислота, соли металлов) вызывают меньшую потерю антигенных свойств, чем формальдегид. Хуже всего идут иммуноцитохимические реакции на препаратах, фиксированных глутаральдегидом.

Долгое время эта ситуация создавала неразрешимую проблему для использования в иммуногистохимической диагностике материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин – стандартный патологоанатомический материал. При необходимости иммуногистохимического исследования приходилось использовать замороженный нефиксированный материал или методы мягкой фиксации (холодный ацетон и др.). В настоящее время решение найдено. Восстановить антигенные детерминанты, которые были изменены при взаимодействии с формальдегидом, в большинстве случаев позволяет высокотемпературная обработка срезов в водных буферных растворах (Shi S. R. [et al.], 1991). Этот метод получил название «тепловое демаскирование антигенов». В англоязычной литературе он обычно называется heat-induced epitope retrieval. Следует отметить, что теоретические основы этого метода пока не разработаны. До сих пор непонятно, почему обработка материала при температуре свыше 100 °C приводит к восстановлению антигенных свойств белков, а не к их денатурации и дальнейшему разрушению антигенных детерминант. Тем не менее многочисленные исследования показывают высокую эффективность процедуры теплового демаскирования (Taylor C. R. [et al.], 1996; Evers P. [et al.], 1998; Kоржевский Д. Э. [и др.], 2005; Сухорукова Е. Г. [и др.], 2012). Причем метод оказался пригоден не только для парафиновых срезов, но и для материала, залитого в целлоидин (Shi S. R. [et al.], 1992a; 1992b; 1993), и даже для срезов, полученных с блоков, залитых в эпоксидные смолы.

В настоящее время разработано множество модификаций способа теплового демаскирования антигенов. Общим для них является прогрев срезов, приклеенных к предметным стеклам, в водных растворах до температуры 95 – 100 °C, а в отдельных случаях – и до 120 °C при повышенном давлении.

С учетом эмпирически установленных особенностей процесса демаскирования в качестве растворов могут быть использованы водные растворы солей различных металлов и буферные растворы при различных pH. Считается, что, помимо гидролиза межмолекулярных связей, образованных благодаря действию фиксаторов, эффективность теплового демаскирования зависит от полноты удаления из срезов ионов кальция. Это достигается введением в буферные растворы солей лимонной кислоты или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, Трилон Б).

Для теплового демаскирования антигенов разработано множество рецептов буферных растворов. В большинстве случаев (если только нет указаний о непригодности этого раствора в аннотации к конкретным антителам) можно применять цитратный буфер (рН = 6,0). По мнению D. J. Dabbs (2006), при отсутствии специального буфера можно использовать дистиллированную воду без добавок. Эффективность демаскирования антигенов в дистиллированной воде ниже, чем при использовании специальных буферных растворов. Наш опыт свидетельствует о том, что при демаскировании антигенов в дистиллированной воде развивается неспецифическое фоновое окрашивание срезов, которое мешает идентификации иммунореактивных структур. Учитывая простоту приготовления цитратного буфера, в общих случаях для демаскирования лучше использовать именно этот раствор.

Как правило, производители первичных антител указывают на необходимость проведения теплового демаскирования для материала, фиксированного в формалине и залитого в парафин, то отмечают, в каком буфере следует производить демаскирование. Наибольшее распространение получили три буферных раствора, применяемых для демаскирования в том случае, когда оно действительно необходимо. Кроме упомянутого цитратного буфера (рН = 6,0), это EDTA-буфер (pH = 8,0) и Tris-EDTA (pH ≈ 10,0). Ряд производителей антител рекомендует для обработки свои оригинальные буферные растворы (например, S-1700 (Dako), CC1 и CC2 (Roche-Ventana), Bull’s Eye Decloaker (Biocare) и др. ). В отдельных случаях эти растворы позволяют добиться лучшего демаскирующего эффекта, чем обычный цитратный буфер (pH = 6,0). Судя по литературе, среди коммерческих буферных растворов наибольшей популярностью у специалистов пользуется модифицированный цитратный буфер с pH = 6,1 (S-1700, Dako).

Одним из недавних усовершенствований технологии теплового демаскирования антигенов является объединение этого этапа обработки препарата с депарафинированием срезов. При этом используются водные растворы детергентов, а не ксилол и аналогичные органические растворители парафина. При прогреве срезов в водных растворах до температуры, близкой к 100 °C, парафин, имеющий сравнительно низкую температуру плавления, уже расплавлен. Трудность заключается в том, чтобы эффективно удалить расплавленный парафин из среза. Для этого в демаскирующий раствор вводятся детергенты. При обработке таким раствором образуется эмульсия парафина в демаскирующем растворе и, соответственно, происходит депарафинирование среза без применения органических растворителей. Наиболее известным коммерческим буферным раствором для одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов является раствор Trilogy (CellMarque, США). Метод одновременного удаления парафина и теплового демаскирования антигенов используется в автоматической системе иммуноокрашивания BenchMark (Ventana, США).