Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты

Приведенные методы пригодны для определения антибиотической активности микроорганизмов только в отношении бактерии, актиномицетов, дрожжевых и дрожжеподобных организмов и грибов. Для выяснения антивирусного или антиопухолевого действия организмов в силу специфичности этих объектов используют другие методы, описанные в 3.7.3, 3.7.4.

Вирусы – внутриклеточные паразиты и поэтому не могут развиваться в виде «чистой культуры» вне клеток своего хозяина. Это обстоятельство и заставляет применять другие методы первоначального отбора активных веществ, отвечающие особенностям развития вирусов.

Метод тканевых культур . Существует несколько вариантов метода тканевых культур, но наиболее удобен метод использования переживающих кусочков хорион-аллантоисной ткани куриного эмбриона в модификации Тама, Фалкерса и Хорсфолла (1953).

Из верхней части куриного яйца с 10-11-дневным эмбрионом вырезают стерильными ножницами шесть кусочков скорлупы с прилегающей к ней тканью хорион-аллантоисной оболочки. Кусочки ткани осторожно отделяют от скорлупы и промывают буферным раствором. Каждый такой кусочек ткани помещают в пробирку с 1 мл среды следующего состава, в процентах (%): NaCl – 0,68, KCl – 0,04, CaCl 2– 0,02, MgSO 4– 0,01, NaH 2PO 4– 0,0125, NaHCO 3– 0,22, глюкоза – 1,0.

Кроме того, в каждую пробирку добавляют пенициллин (100 ед/мл), с тем чтобы предохранить ткань от загрязнения (развития микроорганизмов). Пробирки устанавливают в специальный медленно (около 12 об/ч) вращающийся барабан.

Для выяснения антивирусного действия продуктов жизнедеятельности определенного организма кусочки ткани заражают соответствующим видом вирусов и вносят в пробирки, содержащие культуральную жидкость (при рН 7,0) исследуемого организма. Пробирки помещают в барабан на 48 ч.

Если культуральная жидкость обладает антивирусным действием, то в среде, окружающей ткань, не будет обнаружено вируса. При отсутствии антивирусного действия вирусы будут интенсивно размножаться в клетках ткани, что может быть легко обнаружено методом титрования на эритроцитах.

Метод оценки антивирусных свойств культуральных жидкостей различных микроорганизмов прост, удобен и позволяет сравнительно быстро получить необходимый ответ при массовых испытаниях.

Метод с использованием листьев растений разработан для выяснения антивирусного действия антибиотиков по отношению к вирусу табачной мозаики.

Микроорганизм выращивают на агаровой пластинке в чашке Петри. После достаточно хорошего развития микроба из агара вырезают блочки, которые затем прикрепляют с помощью расплавленной желатины к листьям дурмана, предварительно зараженным вирусом табачной мозаики. Для предохранения от инфекции к желатину добавляют пенициллин. Листья дурмана с агаровыми блочками помещают на несколько дней во влажные камеры. В течение этого периода поверхность листа дурмана покрывается очагами некроза. Но если находящееся в агаровом блочке антибиотическое вещество, образуемое изучаемым организмом, подавляет развитие вируса, то вокруг такого блочка не будет некротических образований, т.е. поверхность листа в зоне действия антибиотиков будет свободной от поражения вирусом табачной мозаики (рисунок 9).

1 – очаги некроза, вызванные вирусом табачной мозаики; 2 – наличие противовирусного действия; 3 – отсутствие действия на вирусы.

Рисунок 9 – Использование листьев дурмана для определения антивирусного действия антибиотиков (по Шорину и др., 1956)

Для окончательной оценки противовирусного действия антибиотических препаратов необходимо использовать животных (чаще всего мышей) или куриные эмбрионы, зараженные вирусами.

Бактерио- и актинофаги – это вирусы микроорганизмов, обладающие рядом свойств, общих с вирусами растений и животных. Определение противофаговой активности микроорганизмов основано на тех же принципах, что и определение противобактериальных свойств организмов.

Культуру, изучаемую на антифаговые свойства, высевают на агаровую или в жидкую среду, благоприятную для образования антибиотического вещества. В качестве тест-объекта используют смесь бактерий и специфического для этой бактерии фага.

При использовании одного из диффузионных методов (метода агаровых блочков, лунок в толще агаровой пластинки, штрихов и т. д.) наблюдается следующая картина. Если антибиотическое вещество подавляет рост фага, то в зоне диффузии антибиотика будет происходить рост используемой бактерии, на остальной же поверхности агаровой пластинки под действием развивающегося фага бактерии будут лизироваться, и поверхность пластинки останется чистой.

Если же под действием изучаемого биологически активного вещества не произойдет развития бактерий и в зоне его диффузии, то это может означать, что используемый в опытах организм не образует противофагового вещества или же образуемое антибиотическое вещество подавляет развитие, как фага, так и бактерии. Последнее легко проверить, если в качестве тест-организма взять только бактерию. Противовирусным действием обладает ряд антибиотических веществ, таких как эрлихин, луридин, фумагиллин, гелиомицин, вирусин и др.

Не всегда антираковое действие препарата совпадает с антибактериальным или антигрибным действием. Поэтому для определения противораковой активности культуральных жидкостей или очищенных препаратов в качестве тест-объектов используют непосредственно раковые клетки. С этой целью применяют методы, основанные на использовании экспериментальных животных, культуры тканей или свободноплавающих в отдельных полостях организма опухолевых клеток (асцитные клетки), окончательная оценка антиопухолевого действия испытуемого вещества проводится в опытах на животных.

Методы с использованием экспериментальных животных . В качестве тест-объекта используются клетки асцитного рака Эрлиха у мышей (клетки находятся в виде взвеси в асцитической жидкости животных). Взвесь асцитных раковых клеток смешивается с равным объемом изучаемого антибиотического препарата и смесь помещается в рефрижератор при 4 °C на четыре часа, после чего ее подкожно прививают мышам.

Для контрольных животных вместо исследуемого препарата используется физиологический раствор. Через 10 дней мышей убивают и определяют наличие опухолей и их размеры. Если изучаемый препарат убивает асцитные раковые клетки, то они, естественно, не дадут образования опухолей.