Алексей Сизенцов - Антибиотики и химиотерапевтические препараты

Разработаны соответствующие поправки, которые необходимо вносить при использовании взвеси спор тест-организмов в процессе определения биологической активности антибиотиков. Поправки по отношению к числовому эквиваленту мутности для взвесей тифозных бактерий следующие:

Споры L2 (типа B.subtilis ) …1/12

Споры В.mycoides .....1/6

Споры В.mycoides (гладкий вариант) …1/5

Зная эти поправки, можно рассчитать число спор в 1 мл суспензии.

Так допустим, что плотность взвеси спор Вас. subtilis соответствует 5 единицам мутности стандарта ГКИ. Зная, что числовой эквивалент указанной мутности для взвесей тифозных бактерий составляет 100 млн/мл × 5 = 500 млн/мл и что соответствующий эквивалент для взвесей спор В.subtilis в 12 раз меньше, находим, что концентрация спор в исследуемой суспензии равна 500 млн/мл / 12 = 42 млн/мл.

Соблюдение указанных основных правил постановки опыта при определении биологической активности антибиотиков методом диффузии в агар позволяет получить вполне сравнимые результаты.

Среди диффузионных методов определения биологической активности наиболее широкое применение нашли три метода, рассматриваемые ниже.

Метод с использованием металлических цилиндриков . На поверхность питательного агара в чашках Петри или в специальных кюветах расставляют металлические цилиндрики (с внешним диаметром 8 мм, внутренним диаметром 6 мм и высотой 10 мм) из алюминия или нержавеющей стали. Как правило, питательный агар используют двухслойный: 1-й слой агара наливают из расчета 15 мл на одну чашку Петри (диаметр 9 см); 2-й слой агара, содержащий определенную плотность суспензии тест-организма, разливают на застывшую поверхность первого слоя агара по 5 мл на чашку. На застывшую поверхность второго слоя агара по специальному трафарету расставляют предварительно простерилизованные металлические цилиндрики (5-6 цилиндриков на чашку).

В одни цилиндрики вносят испытуемый раствор антибиотика, в другие – стандартный раствор того же антибиотика с известным числом мкг или единиц активности в 1 мл раствора. Обычно цилиндрики с испытуемым и стандартным растворами чередуют. Затем чашки или кюветы помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста тест-организма на 20-24 ч, после чего измеряют диаметры зон задержки роста тест-микроба (рисунок 10). Расчет количества антибиотика в 1 мл раствора ведут или по стандартной кривой, полученной на полулогарифмической сетке, или по таблицам Дмитриевой (1958).

Рисунок 10 – Определение биологической активности антибиотиков диффузионным методом с использованием металлических цилиндриков

Метод с применением лунок в толще агара . В толще агаровой пластинки делают лунки диаметром 8 мм. используя пробочное сверло соответствующего диаметра или специально сделанное приспособление, состоящее из резиновой груши, в которую вставляют заостренную с одного конца металлическую трубочку с внешним диаметром 8 мм.

Блочки, надрезанные пробочным сверлом на всю глубину агаровой пластинки, удаляют с помощью стерильного скальпеля или специального крючка. В одни лунки вносят раствор испытуемого антибиотика, а в другие – стандартный раствор антибиотика (рисунок 11).

Метод лунок имеет некоторые преимущества по сравнению с первым методом (нет необходимости в очистке и стерилизации цилиндриков). При использовании цилиндриков, сделанных из алюминия, иногда может происходить взаимодействие кислых антибиотиков с металлом, что приводит к частичной или полной инактивации препарата. При работе с лунками это полностью исключено.

Рисунок 11 – Определение антибиотической активности препаратов в кюветах с использованием лунок в толще агара

При работе с цилиндриками возможно (особенно у начинающих исследователей) подтекание раствора антибиотика из-под неправильно поставленных цилиндриков, что приводит к образованию расплывчатых зон неправильной формы. Метод лунок не дает подобных эффектов.

Метод использования дисков фильтровальной бумаги . На поверхность питательного агара, засеянного тест-организмом, помещают диски фильтровальной бумаги, пропитанные испытуемым раствором антибиотика. В качестве стандарта используют диски, смоченные раствором антибиотика известной концентрации, или специально приготовленные диски, содержащие уже известное количество антибиотиков. Дальнейшие операции проводят так же, как и при работе с применением лунок в толще агара.

В некоторых случаях при использовании бумажных дисков получаются зоны неправильной формы. Это связано с тем, что в данном случае диск фильтровальной бумаги оказывается хроматограммой изучаемого антибиотика и препарат концентрируется в одном участке диска.

Широкое распространение в практике количественного определения антибиотиков нашли турбидиметрические методы, в основу которых положена логарифмическая зависимость степени угнетения роста тест-организма от концентрации антибиотика. Метод основан на измерении концентрации клеток тест-микроба, образующих определенную оптическую плотность среды (мутность) в результате роста в присутствии небольших количеств антибиотика. В присутствии небольших количеств антибиотика не происходит полного подавления роста тест-микроба, а лишь задержка темпа их роста, что и сказывается на оптической плотности бульона.

Турбидиметрические методы определения антибиотиков обычно неприемлемы для плотно окрашенных растворов. Но, учитывая высокую чувствительность этих методов, применяются довольно большие разведения исследуемых жидкостей, что приводит к значительному снижению концентрации пигментных веществ, мешающих проведению анализа; в ряде случаев можно использовать турбидиметрический метод и для окрашенных растворов. Оптическую плотность жидкостей определяют с помощью фотоэлектро-калориметра или обычного турбидиметра.

Эти методы пригодны для количественного определения любых антибиотиков при условии наличия стандартного раствора изучаемого препарата.

При подборе быстрорастущих организмов, используемых в качестве тестобъектов, турбидиметрический метод можно использовать как экспресс-метод – ответ получают через 3,5-4 ч.

Химические и физико-химические методы определения различных групп антибиотиков все шире и шире используются в лабораторной практике. Их преимущество по сравнению с биологическими методами состоит в быстром проведении анализов и, следовательно, в быстром получении ответа. В ряде случаев химические и физико-химические методы несколько уступают по точности биологическим методам. Однако их основное свойство – высокая скорость определения – способствует широкому практическому использованию.