Сэмюел Стернберг - Трещина в мироздании [litres]

Нам оставалось только показать, что все работает именно так, как мы и предположили.

Мартин начал с переноса бактериальной ДНК, кодирующей Cas9, и синтезированной на основе информации от CRISPR РНК в две плазмиды – небольшие колечки ДНК, которые ведут себя как искусственные мини-хромосомы. Первая плазмида содержала генетические инструкции для направляющей РНК, а также отдельные инструкции для человеческих клеток, чтобы они тоже понемногу производили такие молекулы РНК. Во второй плазмиде находился ген cas 9, но он был “гуманизирован” [80] То есть приближен по структуре к генам человека. , чтобы его могли прочесть белок-синтезирующие аппараты человеческих клеток. Мартин также слил с геном cas 9 еще два гена, часто используемых биологами: один, совсем небольшой, под названием клеточный сигнал ядерной локализации, направляющий белок в клеточное ядро, и ген зеленого флуоресцентного белка, благодаря которому каждая человеческая клетка, производящая белок Cas9, должна была засветиться зеленым, если на нее подействовать ультрафиолетом.

Соединив все эти молекулярные компоненты в единую систему, мы с Мартином намеревались превратить человеческие клетки в фабрики для производства CRISPR, которые, сами того не ведая, штампуют молекулы, запрограммированные на разрезание заданных частей собственного генома. И еще мы знали, что CRISPR не убьет человеческие клетки “шинкованием” ДНК, как он делает это с вирусами в бактериях, разрезая вирусную ДНК. ДНК человека (да и всех эукариотических организмов, если уж на то пошло) постоянно получает повреждения – например, это происходит, когда она подвергается воздействию канцерогенных веществ, ультрафиолета либо рентгеновского излучения. И чтобы приводить в порядок поврежденную ДНК, клетки разработали хитроумные системы репарации двуцепочечных разрывов в ней. Таким образом, в самом вероятном сценарии, если CRISPR вырежет нужный ген, клетка ответит на это просто “склеиванием” фрагментов молекулы ДНК обратно в единое целое, будто приварит одну металлическую трубу к другой. Ученые именуют этот процесс негомологичным соединением концов, ведь он, в отличие от гомологичного, не требует ДНК-шаблонов для починки молекулы. (Слово “гомологичный” происходит от греческого homologos , означающего “согласный с законом”.)

Ключевая особенность этого процесса репарации – заложенная в самой его природе небрежность. Как сварщик перед работой должен удостовериться, что у обеих труб очищены торцы, подлежащие сварке, так и клетке перед соединением фрагментов разорванной ДНК тоже нужно убедиться, что концы этих фрагментов чистые. Создание чистых концов иногда требует удаления или вставки нескольких “букв” ДНК, что приводит к изменениям состава генов после окончания процесса репарации. Это означает, что ген, скорее всего, изменится после “атаки” и вырезания его CRISPR и последующей починки за счет клетки. Этот неточный и порождающий ошибки способ репарации должен был обеспечить нам с Мартином простой метод выявления успешных попыток редактирования генов. Выбирая в качестве мишени конкретный ген и анализируя последовательность его нуклеотидов буква за буквой до воздействия CRISPR и после него, мы могли бы найти любой признак неаккуратной репарации, а это доказало бы, что CRISPR обнаружил свою цель и разрезал ее.

Мы с Мартином решили запрограммировать CRISPR таким образом, чтобы он атаковал человеческий ген, который называется ген легкой цепи клатрина A ( CLTA ) и задействован в эндоцитозе – процессе, который клетки используют для захвата питательных веществ и гормонов. Мы не изучали эндоцитоз, но ген CLTA уже был отредактирован по более старой технологии ZFN в лаборатории профессора Дэвида Друбина, которая тоже находится в Беркли. Поэтому мы знали, что редактирование этого гена возможно, а тестирование CRISPR на материале, на котором уже изучали ZFN, помогло бы нам выявить сходства и различия действия двух методов. Конечно, создание инструмента на основе ZFN для редактирования CLTA требовало нескольких месяцев работы и тесного сотрудничества с компанией, бесплатно предоставившей команде Дэвида ZFN (в то время разработка одного ZFN стоила непозволительно дорого – 25 000 долларов). В случае Мартина все было совсем иначе: ему потребовалось всего несколько минут, чтобы смоделировать на компьютере аналогичный [81] То есть атакующей ту же мишень. вариант CRISPR, и синтезировать нужные молекулы можно было за несколько десятков долларов. В конце концов, это и есть одно из главных преимуществ CRISPR – то, что вам фантастически легко указывать в качестве мишени определенные гены. Все, что нужно было сделать, – выбрать желаемую двадцатибуквенную последовательность ДНК для редактирования и затем перевести ее в соответствующий двадцатибуквенный код РНК. Когда эта РНК окажется в клетке, она соединится с подходящей последовательностью ДНК по принципу комплементарности, и Cas9 разрежет ДНК.

Экспериментальной площадкой для нашего первого испытания редактирования генома должны были стать клетки линии HEK 293. Впервые полученные в 1973 году из клеток почки абортированного плода, клетки HEK 293 снискали популярность среди специалистов в клеточной биологии благодаря простоте их культивирования в лаборатории и тому, насколько легко они принимали в себя чужеродную ДНК. Когда мы смешали две плазмиды (одну – с генетическими инструкциями по производству Cas9 и вторую – с генетическими инструкциями по сборке направляющей РНК) в маслянистом растворе молекул, которые называются липидами, то мини-хромосомы (плазмиды) стали спонтанно захватываться жировыми пузырьками, очень похожими на капли жира на поверхности куриного бульона. После того как мы добавили эту смесь к культурам клеток HEK 293, жировые пузырьки должны были слиться с клеточными мембранами и выбросить содержащуюся в них ДНК внутрь клеток. Оказавшись в клетке, ДНК подверглась бы копированию, транскрипции и трансляции, в результате чего получатся белок Cas9 и направляющая РНК, специфически связывающая ген CLTA . Разрезающий ДНК аппарат должен был затем транспортироваться внутрь ядра, где находились наши целевые последовательности ДНК. Мы предполагали, что он найдет правильную двадцатибуквенную последовательность ДНК и разрежет ее. А клетка починит поврежденную ДНК таким образом, что мы это заметим.

Эксперименты Мартина тут же продемонстрировали, что мини-хромосомы действительно давали клеткам человеческой почки возможность производить компоненты CRISPR. Когда Мартин изучал эти клетки под микроскопом, он увидел, что значительная доля клеток светилась зеленым, что могло получиться только в результате образования Cas9, связанного с зеленым флуоресцентным белком. Собрав часть клеток и превратив их в кашицу для анализа различных содержащихся в них молекул РНК, Мартин также обнаружил, что клетки почки производили солидные количества направляющей РНК.