Сэмюел Стернберг - Трещина в мироздании [litres]

Как я сказала ребятам, CRISPR можно представить себе как сделанные на заказ молекулярные ножницы, поскольку их основная функция – “садиться” на заданные двадцатибуквенные последовательности ДНК и разрезать обе цепи двойной спирали. Однако варианты результатов редактирования генома, которых могут добиться ученые, поразительно разнообразны. По этой причине CRISPR лучше сравнить не с ножницами, а со швейцарским ножом, множество функций которого обеспечивает одна и та же молекулярная машина.

Простейший вариант применения CRISPR одновременно и наиболее популярный: систему используют, чтобы вырезать определенный ген и затем дать клетке возможность устранить повреждение повторным соединением цепей ДНК. Этот неточный и чреватый ошибками процесс оставляет явные следы – короткие вставки или делеции ДНК (инделы), стоящие по бокам от последовательности, вырезанной CRISPR. Даже несмотря на то, что ученые не в состоянии контролировать, как именно пройдет процесс репарации ДНК в каждом конкретном случае использования CRISPR, они понимают, насколько полезным может быть такой вариант редактирования генома.

В конце концов, гены – всего лишь носители информации, что-то вроде чертежей здания; цель редактирования генома состоит не в том, чтобы просто изменить чертеж, а в том, чтобы поменять форму здания, которое вы собираетесь построить. Во многих случаях это означает изменение структуры белков, которые кодируются генами и производятся клетками при экспрессии этих генов.

Экспрессия генов – это процесс, в ходе которого не имеющие значения по отдельности “буквы” ДНК дают начало функциональным белкам в соответствии с центральной догмой молекулярной биологии. Сначала в ядре клетки создается временная копия информации с ДНК, именуемая матричной РНК (или мРНК). Как и цепочка ДНК, мРНК представляет собой последовательность нуклеотидов, и она совпадает с таковой для ДНК, которую она воспроизводит (с единственным значимым отличием – тимины (Т) заменены на урацилы (У)). Матричная РНК выводится из клеточного ядра и доставляется к фабрике по производству белков под названием рибосома, а рибосома переводит информацию с основанного на четырех буквах (А, Г, Ц и У) языка РНК на язык белков, алфавит которого состоит из двадцати букв (различных аминокислот). Перевод производится согласно генетическому коду – шифру, в котором каждая тройка “букв” РНК, называемая кодоном, указывает рибосоме, какую одну аминокислоту ей добавить к уже имеющейся цепочке. (Поскольку различных кодонов 64, а аминокислот, которые надо закодировать, только 20 [85] Это лишь основные, существует еще несколько аминокислот, кодируемых мРНК у различных организмов. , многие аминокислоты обозначаются несколькими кодонами, а три кодона служат сигналами остановки, обрывающими синтез белка.) Рибосома собирается на одном конце мРНК и, начиная с него, без пропусков читает один за другим кодоны в составе этой молекулы, добавляя необходимые согласно “правилам перевода” аминокислоты к растущему белку до тех пор, пока не достигнет противоположного конца мРНК; процесс во многом похож на сборку автомобиля на конвейере. Для корректной работы этой системы критически важно, чтобы рибосома работала только с правильной трехбуквенной рамкой считывания; даже минимальный сдвиг этой рамки способен привести к катастрофическим последствиям для процесса трансляции.

Чтобы лучше это понять, представьте себе, что из предложения “Собака тяпнула почтальона за ногу” убрали первую букву и заново разбили предложение на “слова” прежней длины. У вас получится бессмысленное “Обакат япнулап очтальоназ ан огу”. Если рибосома сделает нечто подобное при чтении генетического кода, она соберет на основе искаженного бессмысленного сообщения совершенно неправильную последовательность аминокислот. Ну а если, предположим, получившаяся каша из символов РНК содержит один из трех вариантов стоп-кодонов, процесс трансляции прервется раньше времени. Экспрессия генов нарушится.

Отсюда следует главное свойство CRISPR как средства редактирования генома: он может нарушить способность гена служить источником информации для создания функционирующего белка. Если в отредактированном CRISPR гене появится небольшая вставка или удаление (делеция), структура мРНК, которая была произведена на основе информации от этого гена, также будет нарушена. В большинстве случаев эти лишние или недостающие “буквы” нарушат четкую структуру элементов генетического кода, сгруппированного в тройки, так что белок окажется либо совершенно не таким, каким должен быть, либо, что гораздо вероятнее, вообще не синтезируется. В любом случае белок не сможет корректно выполнять свои функции. Генетики называют это явление “нокаут гена” (KO), по аналогии с боксом: ген тут успешно “вырубили”, и он больше ничего не способен сделать.

Нокаут генов с помощью CRISPR

Когда специалисты по генетике животных начинали использовать CRISPR, они собирались создать четко проявляющие себя генные нокауты. Одной из их излюбленных мишеней был ген под названием TYR . Он возник более полумиллиарда лет назад и широко распространен среди животных, растений и грибов; этот ген кодирует белок тирозиназу, участвующий в процессе синтеза меланина – важного пигмента. Мутации TYR у людей приводят к недостаточности тирозиназы и вызывают кожно-глазной альбинизм I типа – генетическое нарушение, для которого характерны дефекты зрения, бледная, слабо пигментированная кожа и красные глаза. Если CRISPR запрограммировать на редактирование мышиной версии гена TYR , то вызовет ли его действие альбинизм у мышей? В 2014 году коллектив ученых из Техасского университета спроектировал версию CRISPR, атакующую двадцатибуквенную последовательность ДНК в гене TYR , и ввел ее в оплодотворенные мышиные яйцеклетки [86] S.-T. Yen et al., “Somatic Mosaicism and Allele Complexity Induced by CRISPR/Cas9 RNA Injections in Mouse Zygotes”, Developmental Biology 393 (2014): 3–9. . Развившиеся из них грызуны поразили ученых: хотя все их родители имели шерстку нормального темного цвета, многие мышата родились с красными глазами и абсолютно белой шкуркой. Такой результат можно было объяснить только мутациями в ДНК, нарушившими дешифровку гена TYR . Изменение цвета кожи, шерсти и глаз мышей было именно таким четким признаком нокаутирования гена, как того и хотели исследователи.

Хотя по результатам секвенирования ДНК всегда можно подтвердить факт редактирования генома, прелесть использования гена TYR в качестве мишени заключалась в том, что ученые могли увидеть результаты своих экспериментов воочию. Простой подсчет числа черных (тех, у которых редактирования генома не произошло) и белых (тех, чей геном оказался отредактирован) мышат дал удивительно точную оценку эффективности CRISPR. Кроме того, аналогичным способом можно было следить за изменением этой эффективности во времени, по мере того как в различных лабораториях оптимизировали строение и создание CRISPR-систем. В работе техасцев только 11 % потомства родителей, чьи зиготы были отредактированы, были полными альбиносами, и немалое количество мышат на фотографиях этих пометов были черно-белыми – и порой черного у них в шерсти было заметно больше, чем белого. Не прошло и года, как исследовательский коллектив из Японии повторил эти эксперименты с минимальными изменениями методики и добился эффективности в 97 % [87] G. A. Sunagawa et al., “Mammalian Reverse Genetics Without Crossing Reveals Nr 3 a as a Short-Sleeper Gene”, Cell Reports 14 (2016): 662–677. : шерсть тридцати девяти из сорока мышат сияла белизной, а пигментов в радужке не было. Всего за несколько недель ученые точно заданным образом навсегда изменили генофонд целого поколения мышей (и всех их будущих потомков) – таким образом, каким это никогда не задумывала природа.