Чарльз Эллис - Эпигенетика

Прежде чем обсуждать лучше изученные примеры модификаций хроматина, базирующихся на RNAi, у дробянковых дрожжей и Arabidopsis , мы кратко рассмотрим ранние эксперименты, предполагающие участие РНК как посредника в модификациях хроматина и ДНК. Самое раннее свидетельство роли РНК как промежуточного звена в TGS было получено в исследованиях вироидов растений. Вироид веретеновидности клубней у картофеля (PSTV—potato spindle tuber viroid) состоит из РНК-генома величиной 359 nt и реплицируется по механизму РНК-РНК. Введение PSTV в геном табака приводит к метилированию ДНК гомологичных ядерных последовательностей, хотя и трансгенных по происхождению (Wassenegger et al., 1994). Однако эти и интегрированные копии ДНК PSTV становятся метилированными только у растений, которые поддерживают транскрипцию вироидной РНК, что заставляет предполагать участие PHК-посредника, «направляющего» метилирование ДНК (Wassenegger et al., 1994). Далее, у Arabidopsis производство аберрантных транскриптов каким-то образом приводит к метилированию ДНК всех гомологичных промоторных участков и к транскрипционному сайленсингу генов (Mette et al., 1999). Этот факт, вместе с открытием, что репликация вирусных геномов у растений ведет к образованию малых РНК размером 22 нуклеотида, позволяет предполагать, что механизмы, родственные RNAi, опосредуют метилирование ДНК (Mette et al., 2000). Эти наблюдения, а также индуцированный повторами сайленсинг, вызываемый трансгенами, который впервые был обнаружен у петунии и у табака, сейчас широко признаны как самые ранние примеры сайленсинга с помощью RNAi (Napoli et al., 1990; обсуждается в главе 9).

Дальнейшие доказательства связи между RNAi и TGS были получены на Drosophila в исследованиях сайленсинга генов, индуцируемого повторами (глава 5). Введение множественных тандемных копий трансгена приводит к сайленсингу как этого трансгена, так и эндогенных копий (Pal-Bhadra et al., 1999). Этот сайленсинг нуждается в хромосомном белке Polycomb, который также участвует в упаковке гомеотических регуляторных генов в подобные гетерохроматину структуры за пределами их собственных доменов действия (Francis and Kingston, 2001). Кроме того, для этого индуцируемого повторами сайленсинга генов требуется Piwi — свойственный Drosophila член семейства Argonaute, необходимый для RNAi (Pal-Bhadra et al., 2002). У Tetrahymena другой член белкового семейства Piwi, Twil, необходим для накопления малых PFIK и массивной элиминации ДНК, наблюдающейся в соматических ядрах простейших (глава 7). Эти и более поздние результаты, обсуждаемые в разделе 8. позволяют предполагать, что RNAi-путь участвует в сборке структур репрессивного хроматина у мух.

Другие механизмы сайленсинга, индуцируемого повторами, описаны у нитчатых грибов; сюда относятся индуцируемые повторами точечные мутации (RIP — Repeat Induced Point mutation) у Neurospora crassa и npe-мейотически индуцируемое метилирование (MIP — Metylation Induced Pre-meiotically) у Ascobolus immer-sus, которые, по-видимому, осуществляются без участия РНК-посредника, поскольку они происходят независимо от транскрипционного состояния локуса (Galagan and Selker, 2004). Вместо этого в RIP и MIP участвуют спаренные локусы, где (например) две из трех копий гена сайленсированы, что заставляет предполагать какого-то рода механизм взаимодействия ДНК-ДНК, включающий гомологичные локусы для индукции сайленсинга. Напротив, для сайленсинга неспаренной ДНК в мейозе (MSUD — silencing of unpaired DNA in meiosis), который также происходит у Neurospora , требуется RNAi-путь (Shiu et al., 2001; обсуждается в главе 6); возможно, параллели MSUD имеются и у других организмов, в том числе С. elegans (Maine et al., 2005; глава 15).

Хромосомы S. pombe содержат в центромерах и «молчащих» локусах типа спаривания (mat2/3) обширные участки гетерохроматиновой ДНК. ассоциированные с лежащими в их основе повторяющимися элементами ДНК (Grewal, 2000; Pidoux and Allshire, 2004). Каждая центромера дробянковых дрожжей содержит уникальный центральный коровый район (cnt) , который фланкируется повторами двух типов, называемыми самыми внутренними (imr — innermost) и самыми внешними (otr — outermost) повторами (рис. 8.2). Район otr сам состоит из повторов dh и dg.

Формирование гетерохроматина у S. pombe включает совместное действие ряда trans -действующих факторов Сюда входят деацетил азы гистонов (HDACs), Clr4, метилтрансфераза лизина 9 гистона H3 (HKMT) и белки, связывающиеся с H3K9-метилом гистона, Swi6 (гомолог НР1) и Chp1. Предполагается, что первоначальное рекрутирование Swi6 и Chp1 к хроматину приводит к распространению метилирования H3K9 и формированию гетерохроматина через последовательные циклы катализируемого Clr4 метилирования H3K9, сопряженного с опосредуемым Swi6 распространением на соседние нуклеосомы через его самоассоциацию (Grewal and Moazed, 2003).

Мутация в компонентах пути RNAi приводит, как это ни удивительно, к утрате центромерного гетерохроматина и накоплению некодирующих «прямых» и «реверсных» транскриптов с двунаправленных промоторов в пределах каждого повтора dgwdh (рис. 8.2) (Volpe et al., 2002). У дробянковых дрожжей есть единственный ген для каждого из белков RNAi, Dicer, Argonaute и RdRP (i dcrl +, agol +n rdpl + , соответственно). Удаление л юбого из этих генов приводит к утрате метилирования H3K9 гистонов, и мутанты обнаруживают дефекты в расхождении хромосом, которые обычно связаны с дефектами в сборке гетерохроматина (Provost et al., 2002; Volpe et al., 2003). Более того, секвенирование библиотеки малых РНК дробянковых дрожжей выявило РНК длиной ~22 нуклеотида, которые картировались исключительно в районах центромерных повторов и повторов рибосомной ДНК, позволяя предполагать, что сел PHК могут образовывать dsRNAs, которые процессируются в siRNA (Reinhart and Bartel, 2002. Таким образом, было высказано предположение, что путь RNAi может рекрутировать Swi6 и Clr4 к хроматину для того, чтобы инициировать и (или) поддерживать формирование гетерохроматина в каждом из вышеуказанных локусов (рис. 8.3) (Hall et al., 2002; Volpe et al., 2002).

Рис. 8.2.Организация гетерохроматиновых районов хромосомы у S . pombe и A. thaliana

В качестве примера показана центромера хромосомы 1 S. pombe. Уникальный центральный коровый район ( cntl ) фланкирован «самыми внутренними» (imrL и imrR) и «самыми внешними» (otrL и otrR) повторами. Район otr транскрибируется в обоих направлениях, давая начало прямым (синий) и обратным (красный) транскриптам. Участок между генами mat2 и mat3 содержит домен, который гомологичен центромерным повторам dg и dh ( cenH) и также транскрибируется в обоих направлениях. Aftl и Perl — это связывающиеся с ДНК белки, которые действуют параллельно с RNAi, обеспечивая сайленсинг типа спаривания. Центромеры Arabidopsis состоят из повторов длиной 180 п.о. (зеленый), перемежающихся с элементами типа ретротранспозонов (желтый). Показаны прямые транскрипты, инициирующиеся в пределах длинного терминального повтора (LTR), и обратные транскрипты, инициирующиеся в пределах повторов длиной 180 п.о.