Чарльз Эллис - Эпигенетика

Двунаправленная транскрипция центромерных ДНК-повторов в принципе могла бы обеспечить первоначальный источник dsRNA у дробянковых дрожжей (\blpe et al., 2002). dsRNA, получающиеся в результате отжига «прямых» и «обратных» транскриптов, могли бы затем стать субстратом для рибонуклеазы Dicer. Однако РНК-направляемая PHК-полимераза (Rdpl) и связанные с нею кофакторы, а также HKMT Clr4, также необходимы для производства siRNA рибонуклеазой Dicer (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Эти наблюдения показывают, что образование гетерохроматиновых siRNAs рибонуклеазой Dicer сопряжено с событиями, зависящими от хроматина и Rdpl (рис. 8.4).

Фермент Rdpl находится в мультипротеиновом комплексе, который содержит также Hrrl, РНК-геликазу, и Cidl2, члена [3-семейства ДНК-полимераз, включающего поли(А)полимеразные ферменты (Motamedi et al., 2004). Этот комплекс был назван комплексом РНК-направляемой РНК-полимеразы (RDRC — RNA-direct-ed RNA polymerase complex), и для формирования гетерохроматина в районах центромерной ДНК требуются все его субъединицы (Motamedi et al., 2004). Как ожидалось, на основании присутствия Rdpl RDRC обладает активностью PHК-направляемой РНК-полимеразы in vitro, и мутации, устраняющие эту активность, устраняют и зависимый от RNAi сайленсинг in vivo (Motamedi et al., 2004; Sugiyama et al., 2005). Активность RDRC, обусловливающая синтез РНК in vitro, не требует siRNA-праймера (Motamedi et al., 2004). RITS может, следовательно, обеспечить in vivo специфичность путем рекрутирования RDRC к выбранным РНК-матрицам посредством siRNA. В согласии с этой гипотезой, субъединицы RDRC необходимы для генерации siRNA, а комплексы RITS, изолированные из клеток, не имеющих ни одной субъединицы RDRC, лишены siRNAs (Motamedi et al., 2004; Li et al., 2005; Sugiyama et al., 2005; Buhler et al., 2006).

Присутствие Cidl2 в RDRC интригует и ставит вопрос о возможности участия еще одной полимеразной активности в связанном с хромосомой РНК-сайленсинге. Поскольку некоторые члены этого семейства обладают активностью пол и (А) полимеразы, одна из возможностей заключается в том, что аденилирование dsRNA, произведенной Rdpl, может иметь важное значение для их дальнейшего гтроиессталтъ. Интересно, что Cid 12-подобные белки консервативны у всех эукариот (табл. 8.1); результатом мутаций в Rde-З, характерном для С. elegans члене этого семейства, является дефектная RNAi (Chen et al., 2005), что подтверждает консервативную роль этих ферментов в RNAi-пути.

Имеются данные по синтезу и процессингу dsRNA, связанному с образованием гетерохроматиновых siRNAs, происходящим на хромосоме, в сайтах транскрипции некодирующих центромерные РНК (рис. 8.4). Среди них, во-первых, данные о том, что Rdpl может быть присоединена поперечными сшивками к центромерным ДНК-повторам (Volpe et al., 2002; Sugiyama et al., 2005) и к «прямым» и «обратным» РНК-транскриптам, происходящим из этих районов (Motamedi et al., 2004). Как и в случае поперечных сшивок с ДНК, присоединение поперечными сшивками к центромерным РНК требует участия Dicer и Clr4 и, следовательно, является зависимым от siRNA и хроматина. Во-вторых, для производства siRNA требуются компоненты хроматина, в том числе Clr4, Swi6 и РВФС Sir2 (Hong et al., 2005; Li et al., 2005; Buhler et al., 2006). Наконец, ассоциация RDRC с RITS зависит от siRNAs, а также от Clr4, что заставляет предполагать, что она происходит на хроматине (Motamedi et al., 2004). Таким образом, образование dsRNA и.siRNA гетерохроматина может включать рекрутирование RDRC к связанным с хроматином вновь синтезирующимся пре-иРНК-транс криптам, как это показано на рис. 8.5 (Martienssen et al., 2005; Verdel and Moazed, 2005). Тот факт, что транскрипция и образование siRNA происходят, вероятно, одновременно, усиливает различие между механизмами РНК-сайленсинга, опосредующими модификации хроматина, и PTGS. Однако маловероятно, чтобы это различие было абсолютным. Например, у С. elegans мутации в нескольких компонентах хроматина, подобные мутациям у S. pombe , приводят к дефектам в RNAi и индуцируемом транспозонами РНК-сайленсинге (см. табл. 8.1) (Sijen and Plasterk, 2003; Grishok et al., 2005; Kim et al., 2005), и возникает возможность, что в некоторых случаях синтез и процессинг dsRNA могут происходить на хромосоме независимо от того, происходит ли сайленсинг на уровне TGS или же PTGS.

Крайне важным вопросом при разработке роли RNAi в сборке гетерохроматина является вопрос о том, связывается ли RITS/RDRC с ДНК или же с вновь образующейся РНК. Наблюдение, что компоненты механизма

аОчевидный ортолог хромодоменного белка, Chp1, не был идентифицирован у других модельных организмов, перечисленных здесь, но большинство эукариотических клеток содержит множественные хромодоменные белки. СЬЕЗ у Arabidopsis является хромодоменной ДНК-метилтрансферазой, которая работает в том же пути, что и AG04, и может быть аналогичной Chp1.

6Никакие очевидные ортологи Tas3 не были идентифицированы, но имеет место слабое сходство по аминокислотной последовательности с белком, специфичным для яичника и семенника мыши (NP 035152).

вCid 12 относится к большому семейству консервативных белков, имеющих сходство по аминокислотной последовательности с классической поли(А)полимеразой, а также с 2’-5’-олигоаденилатными энзимами.

гС. elegans обладает примерно 20 доменными белками SET, но H3K9 HKMT не была еще идентифицирована у этого организма. д S. pombe содержит другой Rikl-подобный белок, Ddbl, который участвует в репарации повреждений ДНК, но неизвестно, участвует ли он и в формировании гетерохроматина.

RNAi, связывающиеся с транскриптом гена, могут индуцировать зависимый от хроматина сайленсинг генов в cis- положении, ясно демонстрирует, что этот процесс может стимулироваться посредством первоначальных взаимодействий с вновь синтезируемыми РНК-транскриптами (Buhler et al., 2006). Важно, что m-ограничение исключает возможность того, что начальные события синтеза dsRNA и образование siRNA происходят на зрелых транскриптах, где hRNA, полученные с разных аллелей, нельзя различить. Более того, модель РНК-РНК-взаимодействия прямо предсказывает, что для сборки гетерохроматина, опосредованной RNAi, должна быть необходимой транскрипция в локусе-мишени. Хотя эта потребность в транскрипции и не была непосредственно проверена, мутации в двух разных субъединицах РНК-полимеразы II (RNA pol II), обозначаемых Rpb2 и Rpb7, характеризуются специфическими дефектами в образовании siRNA и сборке гетерохроматина, но не в общей транскрипции (Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005). Это заставляет вспомнить мутанты Rbpl, которые характеризовались дефектами в модификациях гистонов (т.е. метилировании H3K4 и убиквитинировании Н2В), сопряженными с элонгацией при транскрипции (Hampsey and Reinberg, 2003), и создает прецедент для предположения о том, что опосредованное RNAi метилирование по H3K9 и формирование гетерохроматина могли бы быть сопряжены с транскрипционной элонгацией через ассоциацию комплексов RNAi с РНК-полимеразой II. В действительности, в противоположность широко принятому мнению о том, что гетерохроматин является недоступной структурой, подавляющей транскрипцию, опосредованная RNAi сборка гетерохроматина очень мало влияет или вовсе не влияет на ассоциацию РНК-полимеразы II с центромерными повторами у S. pombe (Volpe et al., 2002; Djupedal et al., 2005; Kato et al., 2005; Buhler etal., 2006). Следовательно, вновь синтезируемые РНК-транскрипты, действующие как матрицы для RITS в модели РНК-РНК-распознавания, присутствуют в гетерохроматиновых доменах (рис. 8.4).