Чарльз Эллис - Эпигенетика

Среди других мутантов, обнаруженных при скрининге РА 12, были мутанты по гену KYP/SUVH4 (гену H3K9-метилтрансферазы) и содержащему хромодомен гену СМТЗ (гену ДНК-метилтрансферазы). Параллели с дробянковыми дрожжами в этом случае поражают, поскольку комплекс RITS содержит как белок Argonaute, так и хромодоменный белок Chp1, который для своей ассоциации с хромосомой зависит от метилирования H3K9. Однако, в отличие от дробянковых дрожжей, у Arabidopsis утрата СМТЗ или H3K9me2 не приводит к потере siRNA (Lippman et al., 2003), и еще неясно, формируют ли эти белки комплекс с AG04. У Arabidopsis имеются, однако, несколько других HKMTs, специфичных к H3K9; по крайней мере три из них обладают генетической функцией, так что и здесь избыточность может частично объяснять ситуацию (Ebbs et al., 2005)

Рис. 8.6.Белки RNAi и хроматина, необходимые для метилирования ДНК и гистонов, опосредованного RNAi, у Arabidopsis

Синтез dsRNA с повторяющихся элементов ДНК обеспечивает субстрат для опосредованного Dicer расщепления и производства siRNA (DCL3 и другие белки типа Dicer). Направляемые РНК РНК-полимеразы (RdRp, RdR2) и РНК-полимераза IV (RNA Pol IV) могут непосредственно участвовать в синтезе dsRNA или ее амплификации. siRNAs затем грузятся на белки Argonaute (напр., AG04), что, вероятно, в ассоциации с другими факторами помогает «нацелить» похожие повторяющиеся последовательности для метилирования ДНК и H3K9

Мутанты по другим ДНК-метил трансферазам, МЕТ1 и DRM1/2 , в противоположность мутантам по СМТЗ , приводят к утрате накопления siRNA, по крайней мере, с некоей подгруппы транспозонов и с тандемных повторов, которые обычно продуцируют siRNA, если они транскрибируются (Martienssen, 2003). В этих случаях утрата siRNA скоррелирована с потерей H3K9me2 (Cao et al., 2003; Lippman et al., 2003). Мутанты по AT-Фазе DDM1 (decreased DNA methylation) SWI2/SNF2-ремоделинга хроматина также ликвидируют накопление siRNA и H3K9me2 с большой группы транспозонов, хотя в тех случаях, когда siRNA сохраняется, сохраняется и H3K9me2 (Lippman et al., 2003). Возможно поэтому, что siRNA у растений связана с хромосомой через метилированную ДНК вместо связывания (или в дополнение к связыванию) через метилированные гистоны. как это имеет место у S. pombe (рис. 8.7).

DDM1 обладает сильно выраженной специфичностью к транспозонам и повторам и должна как-то распознавать их как последовательности, отличные от генов. siRNA, возможно связанная с хромосомой с помощью метил-связывающих белков, могла бы обладать необходимой специфичностью для такого разграничения. В соответствии с этой идеей, транспозоны и повторы у Arabidopsis являются основным источником siRNA размером 24 нуклеотида и некоторых siRNA размером 21 нуклеотид (Lippman et al., 2004). Центромерные сателлитные повторы, расположенные в виде десятков тысяч тандемных копий по обе стороны каждой центромеры, также транскрибируются И процессируются RNAi (рис. 8.6). Этот процессинг зависит от DCL3, RDR2 и DDM1. Сайленсинг также зависит от H3K9me2 и СМТЗ. Однако сайленсинг здесь более сложный, чем у дробянковых дрожжей, поскольку ретротранспозонные вставки в эти повторы могут сайленсировать их, а это зависит от других механизмов с участием МЕТ1, DDM1 и деацетилазы гистонов HDA6 (May et al., 2005).

Как упоминалось выше, у дробянковых дрожжей субъединицы РНК-полимеразы II (RNA Pol II) необходимы для сайленсинга и производства siRNA, что говорит в пользу идеи, согласно которой аппарат RNAi и модификации хроматина рекрутируется к хромосомам с помощью вновь синтезируемых транскриптов (рис. 8.5). У Arabidopsis две субъединицы новой РНК-полимеразы (RNApol IV) были обнаружены в ходе одного из четырех выше упоминавшихся скринингов (Kanno et al., 2005), но сначала были изолированы как слабые мутанты по PTGS, наряду с мутантами по РНК-зависимой РНК-полимеразе (Herr et al., 2005). Пока еще не известно, какая матрица используется RNA pol IV, но предположили (Vaughn and Martienssen, 2005), что это могут быть и метилированная ДНК (Onodera et al., 2005), и двунитевая РНК. Только самые крупные субъединицы уникальны для RNA pol IV, которая, как предполагается, использует тот же набор малых субъединиц, что и RNA pol II Дополнительные SWI2/SNF2-peмoдeлepы хроматина, которые также были обнаружены в ходе этих опытов по скринингу, могут изменять локальную структуру хроматина и облегчать процессивность RNA pol IV (Kanno et al., 2004). Сходную роль можно предположить для DDM1, хотя потребность для DDM1 (которая также является ремоделером хроматина) в сайленсирующих гранспозонах гораздо более жесткая, чем у RNA pol IV или других белков SWI2/SNF2.

Рис. 8. 7. Гипотетические модели относительно роли RNA pol IVв метилировании ДНК и (или) гистона H3, направляемом RNAi

(a) RNA pol IV транскрибирует метилированную ДНК; КвК2 синтезирует dsRNA, используя продукт, производимый RNA pol IV. Затем siRNAs «направляют» метилтрансферазный комплекс к хромосоме. ( б ) RNA pol IV использует матрицу dsRNA, синтезированную RdR2, для производства большего количества матриц ssRNA

Гены могут быть эпигенетически сайленсированы близлежащими транспозонами; важным примером этого

у Arabidopsis является импринтированный гомеобоксный ген FWA (Kinoshita et al., 2004). Первые два экзона этого гена являются некодирующими и образуют тандемный повтор благодаря древней вставке элемента SINE в этот сайт (Lippman et al., 2004). У мутантов по met1 (т.е. ДНК-метилтрансферазе) siRNAs, синтезированные с элемента SINE, утрачены, и этот ген в меристеме соцветия обнаруживает сильную ап-регуляцию, что приводит к позднему цветению. Такой фенотип не наблюдается у мутантов по RNAi, даже тогда, когда siRNA утрачены. Вместо этого RNAi может играть роль в инициации сайленсинга FWA, потому что трансгены FWA быстро сайленсируются, когда впервые вводятся в растение, и этот сайленсинг зависит от DCL3 , RDR2 и AG04 (Chan et al., 2004). Сайленсинг мог бы затем поддерживаться метилированием ДНК, регулируемым МЕТ1. Подобным же образом аллели FWA, характеризующиеся поздним цветением, стабильно наследуются в бэккроссах после удаления с фона мутантов met1 или ddml, поскольку поддержание эпиаллелей является наследуемым (Soppe et al., 2000).

Наконец, возможно, что при некоторых обстоятельствах miRNA могут направлять метилирование ДНК генов. У Arabidopsis miRNA 165 и 166 делают иРНК с гена PHABULOSA мишенью для расщепления, и сам этот ген метилируется «вниз по течению» от участка, который соответствует miRNA по последовательности. Интересно, что это соответствие распространяется на место присоединения экзона, так что сплайсированная РНК должна взаимодействовать с miRNA, если она «направляет» метилирование (Bao et al., 2004). Однако другие члены того же семейства генов не метилируются таким образом, как и большинство других генов, являющихся «мишенями» для miRNA (Martienssen et al., 2004; Ronemus and Martienssen, 2005). Наоборот, метилируются несколько других генов в геноме Arabidopsis , обычно на их 3’-конце, с помощью механизма, для которого нужен МЕТ1, но не нужен DDM1 (Lippman et al., 2004; Tran et al., 2005). Остается посмотреть, участвует ли в этих случаях РНК.