Карин Мёллинг - Вирусы: Скорее друзья, чем враги

Неожиданно появились новые возможности в плане использования таких технологий для выключения генов. Полная инактивация гена, «потеря функции» позволяет нам выяснить задачи гена. Нет лаборатории в мире, где бы не использовали такую «антисмысловую» технологию, чтобы понять метаболические пути, развитие заболеваний и рака. Такая технология может использоваться для клеточных культур, в исследованиях на животных, но не в исследованиях с участием людей в качестве добровольцев. И что же в результате? Хорошие исследования, идентификация и «валидация» (подтверждение важной роли) целевых генов.

Кроме того, мы использовали часть ДНК для инактивации ВИЧ, «сайленсер ДНК» вместо сайленсера РНК. ДНК в виде U-образной петли направлена против консервативного участка вирусной РНК в частице и активирует молекулярные «ножницы», вирусную РНКазу Н, что приводит к «суициду» ВИЧ. В 2006 г. в материалах симпозиума в Колд-Спринг-Харбор мы обозначили его как сайленсер ДНК «siДНК». Возможно, это станет защитным средством для женщин как вагинальный микробицид против ВИЧ-инфекций; правда, это долгий и затратный путь.

В настоящее время есть новая технология – четвертая терапевтическая нуклеиновая кислота, выделенная из иммунных систем бактерий. Весь мир увлечен ею!

Бактерии спасают гены от инфицирующего фага путем интеграции его ДНК в их геном. Если схожий фаг проникает в бактерию, его распознает РНК, транскрибированная из первого фага, и механизм разрезания уничтожает новый фаг. Система называется CRISPR/Cas9, где Cas9 – молекулярные «ножницы», нуклеаза, осуществляющая вырезание. Исследователи имитируют такой иммунный ответ путем комбинирования нуклеазы с РНК. РНК называется «направляющая РНК» и имеет две функции: нахождение сайта расщепления с использованием гомологических последовательностей и внесение информации, необходимой для генетических изменений. Кроме того, у РНК есть крючок, на котором держится нуклеаза. Генетические изменения описываются как «правка» («редактирование»). В The New York Times была опубликована новость дня – «Правка ДНК». Следует помнить, что компьютерная команда «Правка» означает «изменение». Целевая ДНК вместе с «направляющей РНК» формируют гибрид ДНК–РНК, и при этом ДНК из него вырезается молекулярными «ножницами» Cas9. Они могут вырезать участки ДНК, а концы соединяются клеткой. Или клетка копирует «направляющую РНК» для редактирования. В отличие от других ДНК-модифицирующих технологий, CRISPR может использоваться для изменения специфических генов без «рекомбинации». И это большое преимущество. К тому же до сих пор не существует соответствующих правил или ограничений. В конце 2013 г. Science и Nature признали это одним из величайших 10 прорывов в науке. У журналистов сразу же сложилось свое ви́дение: можно удалять гены, редактировать (изменять) вирусы, бактерии, растения, генетические дефекты, лечить заболевания – модифицировать все мыслимые системы на планете, включая человека. Возможны любые желаемые модификации ДНК в живой клетке и вообще в организме животного, а фактически единовременно можно осуществлять большое число изменений – просто скомбинировать желаемые изменения последовательности на длинной «направляющей РНК». Клетка будет их копировать. Практически ежедневно появляются новые выпускаемые в промышленных масштабах наборы для максимального упрощения этой процедуры. Компании предлагают вирусы для транспортировки комплексов в клетки. Мне на электронную почту приходит ежедневно по три таких предложения. Я видела, как в геном свиньи вносилось сразу 62 правки с целью ее «очеловечивания», чтобы можно было без иммунного отторжения трансплантировать сердце и другие органы этого животного пациентам. Любой студент может использовать этот метод и изменять геномы клеток или эмбрионов для получения трансгенных животных – это почти не занимает времени, хотя раньше докторантам требовалось до трех лет напряженной работы, которая не всегда увенчивалась успехом. А сейчас процесс занимает три недели.

Редактирование – обычное явление в биологии, а не «изобретение» Google. Такой же механизм присутствует и в археях. У африканских трипаносом также широко распространены редактирование и генетическая вариабельность. В тканях головного мозга эмбриона человека редактирование происходит в 35 раз чаще, чем у обезьян. Так что это естественный механизм. Можно ли бактерии со множественной устойчивостью к лекарственным средствам снова сделать чувствительными к антибиотикам? В настоящее время это одна из самых насущных задач в мире. Специалист по синтетической биологии Тимоти Лу из Техасского технологического института пытается это сделать, инфицируя бактерии фагами для редактирования, чтобы вернуть бактериям чувствительность к антибиотикам. В частности, мишенями являются биопленки, содержащие несколько слоев не очень активно метаболизирующихся бактерий, для чего осуществляется редактирование фагов. Редактирование с использованием CRISPR/Cas9 – самое новое, широко разрекламированное направление в исследованиях. Меня это тоже захватило. Новшество данного подхода – быстрота и простота. Существует 20 типов Cas-подобных «ножниц», имеющих различные специфические свойства, и некоторые из них даже вырезают одноцепочечную РНК. Как они будут использоваться?

Некоторых ученых беспокоит вопрос о возможном злоупотреблении данным методом. В СМИ уже появились сообщения о появлении «искусственных детей». В начале 2015 г. китайские исследователи модифицировали гены эмбриона человека, но эти эмбрионы не выжили. Тем не менее можно представить себе эксперименты с реальными эмбрионами человека. «Инжиниринг идеального ребенка» – так была озаглавлена статья, опубликованная издательством Массачусетского технологического института. Годовалому ребенку провели соответствующее лечение, чтобы у него мог прижиться трансплантат, который в противном случае отторгся бы. Этот метод не характеризуется 100%-ной точностью. Существуют так называемые «нецелевые» ( off-target, или побочные) эффекты, которые могут обусловить развитие побочных явлений и редактирование «не тех» генов. Эта проблема типична для нуклеиновых кислот, ее нужно преодолеть, но задача отнюдь не тривиальная. В начале 2016 г. власти Великобритании одобрили использование в лабораториях человеческого эмбриона примерно недельного возраста (пока число клеток увеличится с четырех до 256) для применения CRISPR-технологии и тестирования роли определенных генов на раннем этапе эмбрионального развития. Затем эти клетки подлежат уничтожению. У мышей мышечную дистрофию Дюшенна (генетическое мышечное заболевание у мальчиков) излечили путем вырезания участка генома с генетическим дефектом. Этические комитеты готовятся оценить эту технологию. Самоограничения исследователей – практика, уже используемая в связи с технологиями рекомбинантных ДНК. Впервые эту тему затронули в 1975 г. на Асиломарской конференции из-за страха перед биоопасностью. В конце 2015 г. комитет Международного саммита по редактированию гена человека выступил с заявлением, в соответствии с которым новая технология редактирования генов не может использоваться для модификации эмбрионов человека в период беременности. Дэвид Балтимор из Калтеха, председательствовавший на саммите, сказал: «Ученые должны проявлять осторожность, так как, если в геном внести изменение, это будет необратимо». По мнению некоторых, заявление слишком мягкое. Ежегодно в мире 8 млн детей рождается с генетическими дефектами. Нуждаются ли они в редактировании, в каких бы то ни было изменениях? Где и когда?