Ирина Якутенко - Вирус, который сломал планету. Почему SARS-CoV-2 такой особенный и что нам с ним делать

За создание копий отвечает фермент полимераза {53} 53 Полимеразу, работающую в ПЦР, выделяют из термостойких бактерий, так как технология требует многократного нагревания реакционной смеси до высоких температур . Она садится на нить ДНК или РНК, по одной считывает записанные в ней буквы-нуклеотиды и строит вторую нить, которая повторяет первую {54} 54 Вторая нить не идентична первой: она ей комплементарна. Нуклеотиды как ДНК, так и РНК легко «спариваются» друг с другом: А (аденин) образует пару с Т (тимином), а Г (гуанин) с Ц (цитозином). Соответственно, если полимераза видит последовательность ААТТГГЦАЦ, она построит новую нить ТТААЦЦГТГ. В случае РНК вместо тимина пару с аденином образует урацил (У). . Этот процесс проводят много раз. Для того чтобы полимераза размножала не все имеющиеся нуклеиновые кислоты, а только нужный кусочек, ученые указывают ей, какой фрагмент воспроизводить, при помощи праймеров. Это небольшие отрезки ДНК, которые прилипают к выбранному исследователями месту на копируемой нити. Два праймера с двух сторон ограничивают участок, который должен быть размножен, примерно как таблички с названием населенного пункта на дороге указывают его границы.

Участок для копирования внимательно выбирают так, чтобы он присутствовал только в геноме вируса: так как фрагмент небольшой, может случайно получиться, что очень похожий кусочек будет и в ДНК хозяина. Кроме того, этот фрагмент должен быть достаточно консервативен, чтобы не мутировать каждые пять минут, и при этом отличаться от аналогичных мест в геномах вирусов-родственников. Для того чтобы все получилось и размножились только нужные нам участки, очень важно правильно подобрать праймеры. Они могут плохо липнуть к желаемому участку или прилипать не только к нему, но и к какому-нибудь месту в геноме хозяина или других коронавирусов, и тогда полимераза будет умножать его, а тест — давать ложноположительный ответ. Важен и размер праймеров: слишком короткие будут неизбирательно приставать ко множеству неправильных мест, а специфичные, но слишком длинные могут частично приклеиваться к неправильному участку ДНК — и этого участка будет достаточно, чтобы полимераза начала синтез. В общем, подбор удачного фрагмента и праймеров — тонкое дело, и найти удачную комбинацию удается не всегда. Обычно останавливаются на отрезках, кодирующих какие-нибудь важные сервисные белки, которые обеспечивают собственные нужды вируса. И чаще всего тест-системы выявляют фрагмент не одного белка, а нескольких — такой дизайн практически исключает вероятность кросс-реактивности с похожими вирусами. Тест-системы на SARS-CoV-2 обычно выявляют кусочки генов N- и S-белков.

Если в соскобе с глотки есть вирусная РНК, после того как ученые выделят нуклеиновые кислоты, добавят праймеры и полимеразу и много раз проведут реакцию копирования, в пробирке накопится изрядное количество тех самых заранее выбранных кусочков вирусного генома, и их можно будет детектировать. Если же образец чист, полимераза не сможет ничего размножить, так как праймерам, указывающим ей участок, который нужно копировать, будет некуда приклеиться.

Выше я очень упрощенно описала принцип полимеразной цепной реакции, на которой основан генетический тест на коронавирус — и на многие другие вирусы. Но в случае с SARS-CoV-2 есть еще одна проблема: его геном записан на молекуле РНК, а ПЦР можно проводить только с молекулами ДНК. Поэтому на первой стадии теста выбранный фрагмент РНК превращают в ДНК, используя фермент обратную транскриптазу, или РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Изначально этот фермент тоже был выделен из вирусов. Конкретно — из ретровирусов, которым он необходим, чтобы перевести свой РНК-геном на язык ДНК и встроить в геном клетки-хозяина (на всякий случай, еще раз: SARS-CoV-2 так делать не умеет!). РНК-зависимая ДНК-полимераза садится на нить РНК и строит ее ДНК-копию. Место посадки ферменту опять же указывают праймеры.

Но и это еще не все. Полностью реакция, которую проводят при генетическом тесте на коронавирус, называется ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Такой тип исследования позволяет увидеть, на каком именно цикле умножения ДНК-копий появляется сигнал. По этому параметру можно приблизительно оценить исходное количество РНК в образце, и, главное, результат анализа виден сразу. При проведении классической ПЦР требуется еще один шаг для визуализации размноженных ДНК-фрагментов.

Итак, генетический тест на коронавирус основан на полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Схема всех шагов приведена на рисунке 10. Если сократить описание до одного предложения, получится следующее: ученые проверяют, есть ли в исследуемом образце фрагменты генов вирусных белков. То есть положительный результат генетического теста не говорит, что в глотке человека или в смыве с какой-то поверхности присутствует активный живой вирус, — наличие сигнала свидетельствует лишь, что в образце имеется вирусная РНК. Делать вывод о заразности человека или поверхности только по результатам ПЦР-теста нельзя: вирус может быть давно мертвым или же его количество недостаточно для передачи (мы подробно обсуждали этот вопрос в главе «Как передается коронавирус», но еще вернемся к нему в этой и следующих главах). Чтобы судить о возможной заразности, необходимо проводить длительные эксперименты в лаборатории класса BSL-3: добавить полученный образец к культурам клеток и посмотреть, произойдет ли инфицирование. И даже если клетки заразятся, нельзя однозначно утверждать, что такого количества вируса достаточно для заражения людей.

Впрочем, есть другой способ оценить, свидетельствует ли результат генетического теста о наличии живого вируса в концентрации, достаточной для заражения. Чтобы выяснить это, необходимо внимательно посмотреть на параметры ПЦР-реакции, при которых был получен положительный сигнал. Так как для выявления РНК SARS-CoV-2 используется не просто ПЦР, а ПЦР в реальном времени, мы не только видим сигнал или его отсутствие по итогам нескольких раундов умножения копируемого фрагмента ДНК, но можем сказать, на каком именно раунде (ученые говорят «цикле») он появился. На каждом цикле количество целевых фрагментов в образце удваивается, и, если их изначально много, полимераза насинтезирует достаточное для выявления число копий быстро, то есть за небольшое число циклов. Если исходно в пробирке было мало нитей вирусной РНК (а значит, и синтезированной с них ДНК), потребуется больше циклов удвоения. Соответственно, если мы видим положительный сигнал, скажем, на 34-м цикле, это означает, что исходно РНК в образце очень мало и человек, вероятнее всего, уже — или еще — не заразен. Появление сигнала на 25-м цикле указывает, что РНК очень много, то есть вылетающие изо рта капли слюны содержат большое количество живого вируса и человек вполне может эффективно заражать окружающих.