Ирина Спивак - Репликация ДНК: учебное пособие

Пары оснований в А-форме очень сильно отодвинуты от оси спирали к периферии молекулы – почти на половину радиуса; сдвиг достигает 4–5 Å, а в В-форме ДНК он близок к нулю.

Рис. 9. Возможные формы ДНК

При образовании праймера (подробнее сам процесс его синтеза будет представлен при описании ДНК-полимеразы α эукариот) образуется ДНК-РНК дуплекс, который существует в А-форме. Таким

образом, в А-форме дуплекса обеспечивается оптимальный баланс между гидрофобными и комплементарными взаимодействиями оснований матрицы и праймера.

Рис. 10. Взаимное расположение нуклеотидов в ДНК в В-форме

Многие известные теперь детали процесса репликации ДНК удалось установить благодаря исследованию поведения и активности ферментов, обеспечивающих работу аппарата репликации. Наиболее полно изучен механизм репликации бактериальной ДНК, особенно ДНК Е. соli и бактериофагов, которые в ней размножаются. Довольно хорошо известны и ферменты репликации дрожжей, Drosophila, млекопитающих.

ДНК-подимсразы присутствуют во всех прокариотических и эукариотических клетках. Более того, многие вирусы бактерий и животных индуцируют образование вирус-специфических ДНК-полимераз или белков, способствующих эффективному участию ДНК-полимераз клеток-хозяев в репликации вирусной ДНК.

Многие прокариотические и эукариотические ДНК-полимеразы выделены в чистом виде, а их физические и ферментативные свойства детально охарактеризованы. И хотя эти свойства не совсем идентичны, механизм катализа для всех указанных ферментов в общих чертах одинаков.

Рис. 11. Общий принцип строения ДНК-полимераз.

В первичной структуре ДНК-полимераз эукариот присутствуют консервативные мотивы, гомологичные соответствующим мотивам прокариотических ферментов. Это подтверждает, что все ДНК-синтезирующие ферменты имеют общий план строения. Общий принцип строения ДНК-полимераз показан на рис. 11. По форме ДНК-полимсразы можно уподобить полураскрытой кисти правой руки, в которой ладонь, большой палец и остальные пальцы представляют три основных пространственных домена и формируют полость, удерживающую ДНК-матрицу и затравку в ходе синтеза. Консервативные мотивы А, В и С образуют активный центр в домене «ладони», «пальцы» удерживают однонитевую матрицу, а «большой палец» прижимает праймер – матричный двунитевой участок.

Применительно к различным типам ДНК-полимераз эукариот эта модель может быть модифицирована. ДНК-полимеразы работают совместно с различными белковыми комплексами, удерживающими их в вилке репликации. Чаще всего их называют «зажим» и «загрузчик зажима» («sliding clamp», «clamp loader»).

Рис. 12. Загрузка ДНК-полимеразы

После объединения ДНК-полимеразы с зажимом, «загрузчик зажима» отходит от места реакции, но держится поближе к отстающей нити, чтобы провести загрузку на новом месте объединения праймер-матрица, как только ДНК-полимераза диссоциирует при завершении синтеза предыдущего фрагмента Оказаки. Этот процесс схематически изображен на рис. 12. Подробно об этих комплексах у эукариот и их роли в репликации будет рассказано далее.

Полимеразы прокариот обозначаются римскими цифрами (в отличие от полимераз эукариот, которые обозначаются греческими буквами). Наиболее полно изучена ДНК-полимераза I (Ро11) Е. соli. Она представляет собой одиночный полипептид с мультифуикциональными активностями. В качестве ДНК-полимеразы Ро11 катализирует перенос 5'-дезоксинуклеотидильных единиц дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов к З'-ОН-группе в цепи ДНК или РНК, после чего происходит спаривание перенесенного основания с соответствующим основанием комплементарной цепи ДНК. Таким образом, для полимеризации ферменту необходимы праймер в качестве акцептора дезоксинуклеотида и матрица, определяющая присоединение нужного нуклеотида. Помимо полимеризации нуклеотидов, Ро11 катализирует две другие реакции, биологическая роль которых очень важна. В одной из них происходит гидролиз фосфодиэфирных связей в одной цепи ДНК или на неспаренном конце дуплексной ДНК, причем за один акт удаляется один нуклеотид, начиная с 3'-конца цепи (3'-5'-экзонуклеаза). Вторая реакция также состоит в отщеплении нуклеотидов, но гидролиз начинается с 5'-конца двунитевой ДНК в направлении к 3'-концу (5'-3'-экзонуклеаза). Эти различные активности присущи разным сайтам полипептидиой цепи РоlI, Если in vitro обработать РоlI трипсином, то полипептидная цепь расщепится на большой и малый фрагменты. Большой, С-концевой фрагмент («фрагмент Кленова») сохраняет ДНК-полимеразную и 3' -5'-экзонуклеазную активности; малый N-концевой фрагмент обладает только 5'-3'-экзонуклеазной активностью.

РоlI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК Е. соli. 3’-5'-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов вновь синтезированной цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем РоlI, то при репликации генома часто происходят мутации – замены оснований.

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-конец нити, спаренной с матричной нитью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей нити. РоlI удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды праймера, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку РоlI способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двунитевой ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва (процесс, называемый ник-трансляцией ),этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченой ДНК.