Сергей Павлович - Медицинская паразитология с энтомологией

В основе проявления всех серологических реакций лежит образование иммунных комплексов, регистрируемых невооруженным глазом или с помощью лупы, микроскопа, специальной аппаратуры (например, агглютиноскопа, спектрофотометра, счетчика излучений) или индикатора.

Агглютинацией называется склеивание микробов (клеток) при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Реакцию агглютинации (РА) используют в серо-типаже микроорганизмов, главным образом бактерий, и в серодиагностике инфекционных болезней. Для ее постановки необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген); 2) антитело (агглютинин); 3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

В качестве антигена в РА применяют свежевыросшую взвесь живых или убитых формалином, спиртом, нагреванием культур ( диагностикумов ).

Для получения агглютинирующих сывороток иммунизируют кроликов. При этом им 5–7 раз подкожно, а затем внутривенно с интервалами 2–7 сут в возрастающих дозах вводят убитые бактерии. Заканчивают курс иммунизации животных 2–3 инъекциями живых бактерий. Через неделю определяют титр сыворотки – максимальное ее разведение, которое агглютинирует гомологичный микроорганизм. Если титр сыворотки недостаточен, иммунизацию продолжают.

Полученные таким путем агглютинирующие сыворотки называются неадсорбированными , поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные в антигенном отношении бактерии. Поэтому для определения их вида надо ставить развернутую реакцию с сывороткой, разведенной от 1:100 до ее титра. Сыворотка соответствует микробу в том случае, если агглютинирует его как минимум до половины титра.

Более достоверные результаты при определении вида или серовара бактерий дают адсорбированные (монорецепторные или типоспецифические) сыворотки, которые не имеют групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости их сильно разводить.

Развернутая РА для серотипажа микробов. Ее ставят следующим образом: в агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл неадсорбированной сыворотки, разведенной 1:100, и, перемешав, 1 мл переносят во вторую, из второй – в третью и т. д. Получив двукратные разведения диагностической сыворотки от 1:100 до 1:1600 и более, вносят в них по 1–2 капле 2-миллиардной взвеси бактерий. Контролями служат изотонический раствор натрия хлорида с антигеном и исследуемая сыворотка без него. Пробирки энергично встряхивают и помещают на 2 ч в термостат при температуре 37 °C, затем осуществляют предварительный учет, начиная с контролей.

Отсутствие агглютинации в контроле и наличие взвешенных хлопьев в 2–3 и более пробирках опыта свидетельствуют о положительной реакции (рис. 3). Окончательные результаты учитывают через 18–20 ч, выдерживая штатив с пробирками при комнатной температуре.

Рис. 3. Развернутая реакция агглютинации

Интенсивность реакции выражается плюсами: «++++» – сыворотка прозрачная, с хлопьевидным осадком склеившихся бактерий на дне пробирки; «+++», «++», «+» – убывающие просветления с уменьшением бактериального осадка.

Заостряя внимание на агглютинате, следует указать, что для обнаружения неорганизованных антигенов простейших и гельминтов используют латекс-агглютинацию, адсорбируя их видовые иммуногены или гаптены на латекс-частицах, которые, реагируя с антителами, склеиваются в виде мелкозернистых осадков, какие образуются, например, при агглютинации мельчайших бактерий и риккетсий.

Развернутая РА для серодиагностики инфекционных болезней. Обнаружение в сыворотке больных антител к определенным видам микроорганизмов – косвенный, но очень важный показатель, так как они образуются только под воздействием возбудителя заболевания. Техника постановки развернутой РА для серодиагностики такая же, как в серотипаже. Получив сыворотку больных, ее, как и диагностическую, разводят изотоническим раствором натрия хлорида от 1:100 до 1:1600.

В качестве антигена в этой реакции используют диагностику-мы – заведомо известные взвеси убитых бактерий, с которыми безопасно работать.

Учитывается она так же, как развернутая РА для идентификации бактерий. Обычно клинический диагноз подтверждает наличие агглютината в титре 1:200 и выше. При агглютинации бактерий в более низких титрах сыворотки, что может происходить за счет нормальных антител, имеющихся у здоровых людей или больных другим заболеванием, реакцию агглютинации ставят повторно спустя 3–4 дня с расчетом выявления нарастания титра антител. Нередко динамику нарастания антител прослеживают с самого начала заболевания, для чего исследуют «парные» сыворотки, полученные от больного в разгар заболевания и спустя 7-10 и более суток, когда титр агглютининов под воздействием патогенного микроба повышается в 2–4 и более раз.

В тех случаях, когда в качестве антигена предполагается использовать мельчайшие микроорганизмы, например микоплазмы и вирусы или экстракты и лизаты бактерий, другие высокодисперсные вещества, комплексы которых с агглютининами увидеть невозможно даже в агглютиноскопе, прибегают к постановке реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), сорбируя их на бараньих эритроцитах. Ставится она в лунках полистироловых планшет. По чувствительности и наглядности результатов намного превосходит развернутую РА.

РИГА для серодиагностики инфекционных болезней и инвазий. Для обнаружения антител в сыворотках больных готовят эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого бараньи эритроциты в течение 15 мин обрабатывают раствором таннина в разведении 1:20 000-1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют 2 ч при температуре 37 °C. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают 0,85 %-ным раствором натрия хлорида и в объеме 0,1–0,25 мл 0,5 %-ной взвеси добавляют к сыворотке, разведенной от 1:10 до 1:1280 и разлитой по 0,25-0,5 мл в лунки планшет (рис. 4).

В качестве контроля используют взвеси интактных и нагруженных специфическим антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо отрицательную и положительную реакции.

Рис. 4. РИГА для серодиагностики инфекционных болезней: Эр. Аг – эритроцитарно-антигенный диагностикум; Ат – антитела