Сергей Павлович - Медицинская паразитология с энтомологией

Результаты учитывают через 2 ч после инкубации в термостате. Оценивают РИГА плюсами: «++++» – эритроциты равномерно покрывают всю лунку планшеты в виде зонтика с неровными краями; «+++», «++» – осадок эритроцитов в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из несклеившихся эритроцитов; «+» – в основном видны не склеившиеся эритроциты.

Рис. 5. РИГА для выявления высокодисперсных антигенов: Эр. Ат – эритроцитарно-антительный диагностикум; Аг – антигены

При отрицательной реакции эритроциты спонтанно агглютинируют в виде плотного диска («пуговицы») на дне лунок.

РИГА для идентификации високодисперсних антигенов. Для определения видовой принадлежности антигенов готовят антительный диагностикум, сорбируя на эритроцитах иммуноглобулины известной иммунной сыворотки. Параллельно в лунках полистироловых пластин делают двухкратные разведения антигена в объеме 0,25-0,5 мл и к каждому из них добавляют 0,1–0,25 мл сенсибилизированных антителами эритроцитов (рис. 5). Учет и оценка антительной РИГА для идентификации антигенов производится в те же сроки и по тем же показателям, которые используются в аналогичной ей реакции для серодиагностики болезней.

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора антигена (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых количествах, которые не обнаруживаются в химических реакциях.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические частицы белково-полисахаридной природы, экстракты из микроорганизмов, органов и тканей, продукты распада бактериальных клеток, их лизаты, фильтраты патологического материала. Так как преципитиногены обладают термоустойчивостью, то для их извлечения материалы подвергаются кипячению. В РП используются жидкие и прозрачные антигены.

Преципитирующие сыворотки обычно получают путем гипериммунизации кроликов в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Титр преципитирующей сыворотки в отличие от титра других диагностических сывороток определяется максимальным разведением антигена, который преципитируется в ней. Это объясняется тем, что преципитиноген, участвующий в РП, содержит в единице объема гораздо больше частиц, чем содержится антител в преципитирующей сыворотке такого же объема. В связи с этим преципитирующие сыворотки выпускают с титром не ниже 1:100 000.

Реакция кольцепреципитации Асколи. В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведен-ной преципитирующей сывороткой в объеме 0,5–1 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена. Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости.

Рис. 6. Реакция преципитации: а – реакция Асколи: 1 – опыт; 2 – контроль; б – реакция Оухтерлони: 1 – специфическая иммунная сыворотка; 2 – нормальная сыворотка; 3 – известный антиген; 4 – неизвестный антиген

Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1–2 ч или через 20–24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета (рис. 6, а). Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакцию кольцепреципитации широко используют не только в диагностике инфекционных болезней бактериальной природы, но и в судебной медицине – для определения видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен; в санитарной практике – при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. С ее помощью удается определить степень родства различных видов животных и растений.

Реакция преципитации Оухтерлони. Так как реакцию Оухтерлони ставят на чашках Петри в лунках пластинчатого агара, то ее также называют реакцией преципитации в агаровом геле (РПГ). При этом исследуемые и известные антигены вносятся в одни противостоящие лунки, а иммунные и нормальные сыворотки – в другие, после чего РПГ помещают на 24-48-72 ч в термостат. Диффундируя в агар навстречу друг другу, антитела и антигены при положительной реакции образуют иммунные комплексы, визуально обнаруживаемые в виде белых полос между лунками (рис. 6, б). В различных модификациях реакция

Оухтерлони используется в диагностике вирусных и бактериальных заболеваний.

При постановке реакции гемолиза используют бараньи эритроциты, гемолитическую сыворотку, содержащую специфические к ним гемолизины, и комплемент. Протекает она в две фазы: в первой – эритроциты взаимодействуют с гемолизинами сыворотки, во второй – сенсибилизированные лизинами эритроциты растворяются под действием комплемента.

Гемолиз происходит при наличии строго определенного соотношения используемых в реакции ингредиентов (табл. 1).

Бараньи эритроциты для реакции гемолиза получают в день ее постановки. Кровь дефибринируют во флаконе со стеклянными бусами, далее готовят 3 %-ную взвесь, отмывая эритроциты изотоническим раствором натрия хлорида при центрифугировании.

Гемолитическую сыворотку готовят в производственных институтах, вводя кроликам парентерально 3–4 раза по 2–5 мл 50 %-ной взвеси бараньих эритроцитов. Для реакции гемолиза пригодна сыворотка с титром не ниже 1:1200, но в опыт берется в тройном титре, т. е., если титр гемолитической сыворотки равен 1:1200, то используют титр 1:400.

Таблица 1.

Схема постановки реакции гемолиза

Титром гемолитической сыворотки называют ее максимальное разведение, которое в присутствии комплемента при 37 °C вызывает полный гемолиз бараньих эритроцитов в течение 1 ч.

В качестве комплемента применяют сыворотку крови морских свинок, точнее, производственный сухой комплемент, который при правильном хранении не теряет своей активности 1–2 года.

Учет реакции производят через 1 ч после инкубации пробирок в термостате при температуре 37 °C.