Коллектив авторов - Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных

Подготовка клеток для репликации вирусной ДНК. В ходе продуктивной вирусной инфекции многие ДНК-вирусы из единственной молекулы генома могут получить 100000 или больше копий генома в течение нескольких дней. Для этого требуется работа множества белков, включая ДНК-связывающие белки и полимеразы, а также обильная поставка нуклеотидов. Репликация некоторых ДНК-вирусов происходит только в клетках, которые естественно реплицируют свою собственную ДНК, обеспечивая тем самым необходимую клеточную среду для репликации вирусной ДНК. Другие ДНК-вирусы также в значительной степени полагаются на клеточные системы репликации ДНК, но эти вирусы кодируют белки, стимулирующие клеточный цикл деления. Наконец, некоторые из самых больших ДНК-содержащих вирусов ограничено используют клеточный репликативный аппарат, т.к. сами кодируют вирусные версии многих из необходимых белков.

К первой группе вирусов относятся самые простые ДНК-содержащие вирусы семейства Parvoviridae , которые имеют линейный однонитевой геном. Парвовирусы могут реплицировать свою ДНК и осуществлять полный инфекционный цикл только в клетках, находящихся в стадии репликации ДНК – то есть в S-фазе клеточного цикла.

Фактически, экспрессия вирусных генов не активизируется до тех пор, пока клетка не войдет в S-фазу и ДНК-геном вируса не будет преобразован в двунитевую РФ, которая является матрицей для транскрипции. Однако, в отличие от других вирусов, которые требуют, чтобы клетки активно копировали свою ДНК, парвовирусы неспособны стимулировать переход клетки в S-фазу. В связи с этим, они могут выполнять успешную репродукцию только в том случае, если попадают в клетку, уже осуществляющую синтез ДНК. Некоторые парвовирусы, особенно аденассоциированный вирус (AAV), имеют даже более строгие требования и могут копироваться только в присутствии помощника – аденовируса или вируса герпеса, генные продукты которых активируют экспрессию геновпарвовируса и репликацию его ДНК.

Другие ДНК-вирусы для того, чтобы создать условия для репликации своей ДНК, стимулируют клетки к делению. Для этих вирусов репликация вирусной ДНК является результатом взаимодействия между клеточными репликативными белками и вирусными белками, которые прямым образом участвуют в репликации, а также белками- инициаторами, которые локализуются в точке начала репликации вирусного репликативного аппарата. Эти ДНК-вирусы перестраивают репликативный аппарат клетки на вирусную репликацию, участвуя в белок-белковых взаимодействиях с ключевыми клеточными регуляторными молекулами, некоторые из которых выполняют роль шаперонов, что позволяет им стабилизировать белковые комплексы. Часто, эти взаимодействия приводят к нейтрализации клеточных белков-репрессоров опухоли типа транскрипционного фактора p53 и членов семейства ретинобластомых белков (Rb) и, как следствие, к активации клеточного роста.

Вирусные белки, которые стимулируют репликативное состояние клетки, обычно инактивируют членов семейства Rb – P105Rb, p107, и p130. Инактивация Rb предотвращает репрессию клеточного деления и разрешает E2F-опосредованную транскрипцию, что стимулирует выражение многочисленных клеточных белков, требуемых для S-фазы, включая ДНК-полимеразу α, тимидинкиназу, рибонуклеотидредуктазу и тимидилатсинтазу. Некоторые вирусные белки, например, Е1А аденовирусов и Е7 папиломавирусов человека, непосредственно связывают Rb белки и ингибируют их функцию, и таким образом активируют E2F. Другие вирусные белки регулируют активность циклин-зависимых киназ (Cdks), которые катализируют фосфорилирование Rb, приводя к активации E2F и транскрипции E2F-регулируемых генов. Ряд вирусных белков могут косвенно влиять на регуляцию клеточного цикла деления. Например, E1B-55КБ и E4orf6 белки аденовирусов и E6 папиломавирусов запрещают действие транскрипционного фактора p53 через взаимодействие с CBP/p300, который является коактиватором гена p53. Отмена функции p53 приводит к уменьшенной экспрессии ингибитора клеточного деления p21 (репрессор комплекса Cdk–циклин), таким образом активируя Сdk и соответственно переход клеток в S–фазу. Точно так же, аденовирусный E1A связывает p27, который является ингибитором Сdk, нейтрализуя его эффекты. Большой T антиген обезъяньего вируса SV40 не только связывает и инактивирует Rb и p53, но и выполняет несколько функций, непосредственно требуемых для репликации ДНК вируса. Другой механизм используют средний T-антиген полиомавирусов и белок E5 папиломавирусов быка. Эти белки активируют сигнальный каскад, опосредованный рецептором фактора роста, и возможно стимулируют экспрессию регуляторной субъединицы Сdk – циклина D, таким образом стимулируя активность Сdk и фосфорилирование белков семейства Rb. Некоторые белки вирусов герпеса и гепаднавирусов по всей вероятности также стимулируют каскады сигнальных путей, активизируя внутриклеточные белки передачи сигнала NFKB, P21ras и pp60c-src.

Индукция набора клеточных репликативных белков имеет глубокие последствия на клетку-хозяина, которая насильно побуждается к репликации ДНК. Когда пролиферативный сигнал устойчиво поддерживается, например, в непермиссивных клетках, которые не способны поддерживать репликацию вирусной ДНК, клетки могут подвергнуться устойчивой трансформации. Таким образом, мало того, что многие ДНК- вирусы стимулируют статические клетки к повторным циклам деления, они также трансформируют клетки в культуре и вызывают опухоли у животных. Рассмотренная способность многих опухолеродных ДНК-вирусов стимулировать неограниченный рост клеток не является особенностью нормальной репликации вирусов, а скорее представляет собой аберрантный ответ клеток на вирусную инфекцию. В соответствии с этим, парвовирусы, неспособные стимулировать репликацию клеточной ДНК, являются одними из немногих ДНК-содержащих вирусов, которые не трансформируют клетки. Однако способность вирусов стимулировать синтез клеточной ДНК не всегда коррелирует с их способностью трансформировать клетки. Например, одни вирусы герпеса стимулируют синтез ДНК, другие нет, и, тем не менее, они фактически запрещают быстрое клеточное деление. Такие большие вирусы с их большой кодирующей емкостью способны создать надлежащую среду для репликации вирусной ДНК без активации клеточного репликативного аппарата.

Необходимость нуклеотидов для репликации ДНК. Как описано выше, для репликации парвовирусов необходимо, чтобы клетки находились в S-фазе, а папиломавирусы, полиомавирусы и аденовирусы стимулируют клетки, чтобы ввести Sфазу, требующую для синтеза ДНК большой концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Через воздействие на членов белковых семейств Rb и E2F, папиломавирусы и аденовирусы стимулируют синтез фермента рибонуклеотидредуктазы, который требуется для поддержания достаточного для вирусной репликации уровня дНТФ. Напротив, вирусы герпеса и поксвирусы способны реплицироваться в покоящихся клетках. Одной из причин того, что эти вирусы могут обходить требование к S-фазе является их способность кодировать ферменты для синтеза дНТФ – рибонуклеотидредуктазу и тимидинкиназу. В случаях вируса герпеса и вируса опоясывающего лишая/ветряной оспы вирусная тимидинкиназа является ключевой точкой для противовирусной химиотерапии, потому что этот вирусный фермент фосфорилирует аналоги нуклеозида, такие, как ацикловир, более эффективно, чем это делают клеточные ферменты. Преобразованные в фосфорнокислую форму эти аналоги дНТФ выборочно вредят репликации ДНК герпесвирусов.