Чарльз Эллис - Эпигенетика

Приведенное выше обсуждение показывает, что мы узнали довольно много относительно молекулярных событий, которые лежат в основе появления метилированной ДНК промотора, а также генного сайленсинга в процессе развития опухоли, но едва ли не больше явлений еще требует прояснения. В табл. 24.5 суммированы как минимум некоторые наиболее важные вопросы, которые должны быть решены в будущих исследованиях. Во-первых, должны быть прояснены молекулярные события, определяющие одновременное появление общего гипометилирования ДНК и более локализованное гиперметилирование ДНК промотора. Эти перекрывающиеся состояния предполагают масштабные ошибки в нацеливании хроматина (мистаргетинг) в раковых клетках. Этиология этого явления должна послужить разъяснению того, как клетки млекопитающих укладывают свои геномы для создания соответствующих паттернов генной экспрессии и для поддержания целостности хромосом. Во-вторых, необходимо обрисовать детерминанты границ хроматина вокруг промоторов индивидуальных генов и их корреляцию как с нормальным, так и с аномальным состоянием транскрипции. Сами ли белки-инсуляторы, вовлеченные в защиту активных в норме генов от вторжения транскрипционно-репрессивного хроматина, и(или) модификации гистонов, устанавливают границы? Как могли бы эти детерминанты границ изменяться в процессе развития опухоли? В-третьих, каков порядок событий для появления аномального генного сайленсинга в раковых клетках? Требуется ли начальная даун-регуляция транскрипции гена? Предшествуют ли таргетному метилированию ДНК ключевые модификации хроматина, в том числе деацетилирование и метилирование гистоновых аминокислот и рекрутирование ферментов, которые служат связующим звеном в этом процессе (см. главу 10)? Если да, то каковы молекулярные взаимодействия, лежащие в основе такого таргетинга, и какую роль играют ключевые комплексы сайленсинга (такие как белки группы Polycomb, — см. главу 11), важные для нормальных и раковых стволовых клеток. В-четвертых, какие именно DNMT требуются для инициации и поддержания аномального метилирования ДНК промотора при раке, и как они взаимодействуют? Какой из компонентов хроматина, описанных выше, может взаимодействовать с этими ферментами и направлять их? Наконец, если аномальный генный сайленсинг уже установился при раке, какова точная иерархия молекулярных этапов, которые поддерживают его? Этот последний вопрос является не только ключевым фундаментальным вопросом, но и центральным в плане использования в медицине (что будет обсуждено далее) для реверсии аномального генного сайленсинга при профилактике и лечении рака.

Тот факт, что локальное гиперметилирование островков CpG является таким обычным в раковых клетках, в сочетании с возможностью определять метилирование с высокой степенью чувствительности, привело к развитию нескольких подходов по определению рака с использованием жидкостей организма. Приобретенные изменения в метилировании островков CpG могут быть определены на фоне, характерном для нормальных клеток, после конверсии цитозинов в урацилы, при том, что 5-метилцитозин в ДНК, обработанной бисульфитом натрия остается интактным. Очень чувствительными являются методы ПЦР, например ПЦР, специфическая к метилированию (MSP-methylation-specific PCR), при которой праймеры сконструированы так, чтобы амплифицировать только метилированные участки. Другие методы включают способы, основанные на ПЦР в реальном времени, такие как «MethyLight», где флуоресцентный зонд, который может связываться только с метилированной ДНК, используется для выявления паттернов метилирования (как показано на левом рисунка титульной страницы, где на оси Y — гены, а на оси X — типы опухолей). Эти методики могут выявлять одну метилированную аллель на фоне примерно 1,000-10,000 аллелей. Таким образом, приобретение аномального паттерна метилирования может быть легко определено; эти подходы применимы к смесям клеток или даже к разным биологическим жидкостям, таким как плазма крови, моча или мокрота (Laird, 2003). Диагностика рака посредством идентификации измененного метилирования цитозина довольно надежная из-за свойственной ДНК стабильности, в отличие от РНК и белков. Кроме того, из-за того что измененные паттерны метилирования часто канцероспецифичны, эти методы могут быть способны отличить один тип рака от другого. Сейчас имеется целый ряд исследований, как было упомянуто выше, обеспечивающих «proof of principle» для многообещающего использования гиперметилированных последовательностей ДНК промотора как исключительно чувствительной стратегии для предсказания риска раковых заболеваний или выявления их. Окончательное доказательство того, насколько ценным этот подход окажется для клиники, дожидается более широких исследований, в которых будет дана полная оценка современных гипотез. Такие исследования безусловно будут проведены в ближайшие несколько лет.

Наследуемая инактивация генов, имеющих отношение к раку, при помощи измененного метилирования ДНК и модификации хроматина привела к осознанию того, что сайленсированный хроматин может представлять собой жизнеспособную мишень для терапии. Таким образом, был разработан новый терапевтический поход под названием «эпигенетическая терапия», при котором лекарственные препараты, способные модифицировать хроматин или паттерны метилирования ДНК. используются либо по одному, либо в комбинации (рис. 24.7), чтобы повлиять на терапевтический результат (Egger et al., 2004).

Аналоги нуклеозидов, 5-азацитидин, 5-аза-2’-дезоксицитидин, и зебуларин, являются мощными, основанными на известных механизмах (mechanism-based) ингибиторами метилирования цитозина ДНК (рис. 24.7а). Эти препараты включаются в ДНК делящихся клеток после того, как в ходе метаболизма они превращаются в соответствующие дезоксинуклеозид-трифосфаты. Будучи включены в ДНК, они взаимодействуют со всеми тремя известными метилтрансферазами ДНК и образуют ковалентные промежуточные продукты, которые в конечном счете ингибируют метилирование ДНК в последующих раундах синтеза ДНК. Механизм действия этих веществ вполне понятен и их использовали в течение некоторого времени, чтобы реактивировать «молчащие» гены в культуре ткани или в моделях с ксенотрансплантациями (xenograft). Однако недавно они нашли применение при лечении некоторых гематологических злокачественных заболеваний, в частности, миелоидного диспластического синдрома (MDS), который является предлейкемическим состоянием, возникающим, в основном, у пожилых пациентов (Lubbert, 2000; Wijermans et al., 2000; Silverman et al., 2002; Issa et al., 2004). Клинические реакции для пациентов с таким нарушением и с лейкемиями, которые могут развиться из предлейкемического состояния, становятся все более драматичными. Соответственно, лекарства на основе 5-азацитидина и 5-аза-2’-деоксицитидина (их клинические названия — Видаза (Vidaza) и Децитабин (Decitabine), соответственно) сейчас одобрены American Food and Drug Administration (FDA) для лечения пациентов с данными нарушениями. Зебуларин (Zebu-larine), который также является основанным на известных механизмах (mechanism-based) ингибитором ДНК-метилтрансфераз, находится на более ранней стадии клинической разработки. К настоящему моменту не обнаружены эффективные ингибиторы, не требующие включения в ДНК, но для клинических целей они могли бы быть более желательны, так как могли бы давать меньше побочных эффектов. Сейчас предпринимаются многочисленные попытки синтезировать и (или) обнаружить такие препараты.