Чарльз Эллис - Эпигенетика

Дробянковые дрожжи являются очень полезным модельным организмом для изучения «молчащего» хроматина и связанных с этим эпигенетических эффектов. Они непохожи на S. cerevisiae , но более сходны с N. crassa, растениями и многоклеточными животными в отношении механизмов, которые они используют для достижения сайленсинга через гетерохроматин. И у S. cerevisiae , и у S. pombe теломеры и районы локусов типа спаривания в геноме подвержены сайленсингу, и, кроме того, у S. pombe сайленсинг обнаруживают центромеры. Однако, как описано в главе 4, S. cerevisiae используют для достижения сайленсинга хроматина уникальный набор белков — белки Sir. С другой стороны, дробянковые дрожжи и другие эукариоты, по-видимому, используют сочетание различных модификаций гистонов (в частности, метилирование гистона H3K9) и белки РНК-интерфернции (RNAi) для того, чтобы сайленсировать хроматин. Как детально обсуждается ниже, в исследованиях на S. pombe обнаружили, что этот «молчащий» хроматин имеет существенное значение для функционирования каждого специализированного района гетерохроматина (т.е. центромер и локусов типа спаривания). В центромерах гетерохроматин необходим для обеспечения нормального расхождения хромосом (Allshire et al., 1995; Ekwall et al., 1995), тогда как в локусах типа спаривания он облегчает и регулирует переключение типа спаривания (обзор см. Egel, 2004). Кроме того, «молчащий» хроматин формируется по соседству с теломерами, хотя для этого теломерного «молчащего» хроматина еще нужно найти функцию (Nimmo et al., 1994; Kanoh et al., 2005). Маркерные гены, вставленные в рДНК, тоже сайленсируются (Thon and Verhein-Hansen 2000; Cam et al., 2005).

В отличие от N. crassa и высших эукариот, у S. pombe , по-видимому, отсутствует сколько-нибудь заметное метилирование ДНК (Wilkinson et al., 1995) — обычный механизм, используемый для сайленсирования хроматина у многих эукариот (главы 9 и 18); так, сайленсинг у дробянковых дрожжей опосредован главным образом модификациями хроматина. Как обсуждается ниже, для установления этих модификаций и, таким образом, «молчащего» хроматина используется машинерия RNAi.

Формирование гетерохроматина в центромерах дробянковых дрожжей важно для обеспечения нормального расхождения хромосом при делении ядра. Исследования показали, что центромера в действительности состоит из двух различных хроматиновых структур: гетерохроматина и содержащего CENP-Акинетохорного хроматина Это было продемонстрировано путем изучения варьирующего сайленсинга репортерных генов, вставленных в разные центромерные участки.

На уровне ДНК центромерные районы у дробянковых дрожжей состоят из внешних [outer] повторов (подразделенных на элементы, известные как dg и dh, или К и L), которые фланкируют центральный домен, включающий внутренние [inner] повторы (imr, или В), и центральный кор (cnt, или СС) (рис. 6.2а). Три центромеры, сеп 1, cen2 и cen3, занимают -40, -60 и -120 т.о. на хромосомах I, II и III, соответственно (обзоры см. Egel, 2004; Pidoux and Allshire, 2004). Повторяющаяся природа центромерной ДНК у дробянковых дрожжей напоминает более крупные, более сложные повторяющиеся структуры, связанные с центромерами многих многоклеточных животных, но с ними легче манипулировать (Takahashi et al., 1992; Steiner et al., 1993; Ngan and Clarke, 1997). Поскольку у других эукариот повторяющаяся ДНК часто коррелирует с присутствием гетерохроматина (см. также главу 5), наличие повторяющейся ДНК в центромерах дробянковых дрожжей позволяет предполагать, что они могли бы обладать такими свойствами гетерохроматина, как способность препятствовать экспрессии генов. Как описывается ниже, два блока гетерохроматина фланкируют центральный домен каждой центромеры дробянковых дрожжей. Сам этот центральный домен собран в хроматин другого типа (CENP-A-хроматин), который отличается от соседнего гетерохроматина.

Хорошо известно, что тип хроматина, окружающего ген, может сильно влиять на его экспрессию. Первоначально это было продемонстрировано у плодовой мушки Drosophila melanogaster, где хромосомные перестройки, перемещающие ген white в соседство с центромерным гетерохроматином, приводят к его варьирующей экспрессии в глазных фасетках и, таким образом, к мозаичной окраске глаза (см. рис. 5.1 в главе 5). Сейчас очевидно, что трансгены у многих организмов могут испытывать влияние того окружения, в котором они оказались.

У дробянковых дрожжей сайленсинг генов можно отслеживать с помощью фенотипических тестов, подобных тем, которые используются у S. cerevisiae и оценивают экспрессию репортерных генов. Например, когда репортер ura4 + сайленсирован, формируются колонии, резистентные к 5-фтороротовой кислоте. Другой пример: сайленсинг репортера ade6 + приводит к образованию красных, а не белых колоний (рис. 6.3а). Перемещение нормально экспрессирующегося гена, такого как ura4 + или ade6+, внутрь центромеры (что определяется по элементам внешних повторов и центрального домена) приводит к его транскрипционному сайленсингу. Сайленсинг во внешних повторах очень прочный — такой, что большинство клеток формируют колонии, в которых стабильно поддерживается репрессия маркеров (т.е. в случае репортера ade6 4формируются красные колонии). Однако в центральном домене сайленсинг ade6 + сравнительно нестабилен, результатом чего являются мозаичные колонии, выглядящие как секторированные колонии с красными, белыми либо краснобелыми секторами (рис. 6.3а). Однако на расстоянии всего 1 т.о. дистально от внешних повторов никакого сайленсинга не происходит (Allshire et al., 1994, 1995), показывая тем самым, что эта репрессия транскрипции ограничена центромерой, определяемой центральным доменом и фланкирующими внешними повторами.

Рис. 6.2.Отличающийся гетерохроматин внешних повторов и центральные кинетохорные домены в центромерах дробянковых дрожжей

(а) Изображение центромеры дробянковых дрожжей. Центральный домен ( розовый цвет , кинетохор) состоит из элементов imr и cnt, внешние повторы содержат транскрибируемые повторы dg и dh ( зеленый цвет , гетерохроматин) Все три центромеры имеют сходное общее устройство; однако число внешних повторов различается: cenl (10 т.о.) имеет два, cen2 (65 n/j/) имеет три и cen3 — приблизительно тринадцать. Кластеры генов тРНК ( двойные концы стрелок ) находятся в районе imr и на концах всех трех центромер. Транскрипция маркерных генов, помещенных внутрь внешних повторов или в центральный домен, сайленсируется. (b) Гетерохроматин : внешние повторы упакованы в нуклеосомы, которые метилированы по H3K9me2, что делает возможным связывание хромодоменных белков Chp1, Chp2 и Swi6. Центральный «кинетохорный» хроматин : CENP-A обнаруживается в центральном домене, где он, вероятно, замещает большую часть H3, чтобы сформировать специализированные нуклеосомы ( розовые квадратики ). Было показано, что, в дополнение к CENP-A, несколько кинетохорных белков (указаны) связываются с нуклеотидными последовательностями центрального домена, но не с внешними повторами. Сборка кинетохора в центральном домене опосредует прикрепление к микротрубочкам после образования веретена и расхождение хромосом. Мутация компонентов гетерохроматина облегчает сайленсинг маркерных генов во внешних повторах, но не в центральном домене. Дефекты в некоторых компонентах кинетохора делают возможной экспрессию маркерных генов в центральном домене, но не во внешних повторах