Чарльз Эллис - Эпигенетика

Были протестированы не все белки кинетохорного домена, но создается впечатление, что сайленсинг в центральном домене является результатом сборки интактного кинетохора, который, как и у S. cerevisiae , включает по меньшей мере 50 белков (Measday and Hieter, 2004). Этот крупный комплекс белков предположительно ограничивает доступ РНК-полимеразы II к репортерным генам, помешенным в этот район, и тем самым тормозит их транскрипцию. У таких мутантов, как cnpl , mal2 , mis6 и sim4 , при пермиссивной температуре целостность кинетохора, несомненно, частично нарушена, и это делает возможной увеличенную транскрипцию репортерных генов. Побочный результат этого состоит в том, что в норме «молчаший» репортерный ген был использован для тестирования дефектов в хроматине центрального кора, что привело к идентификации новых кинетохорных белков (Pidoux et al., 2003).

Рис. 6.4.«Молчащий» хроматин в ядрах S. pombe

Два интерфазных ядра с гетерохроматином (центромеры, теломеры и «молчащие» локусы mat2-mat3), декорированных красной флуоресцентной иммунолокализацией Swi6, и кинетохорный хроматин (только центромеры), декорированный зеленой флуоресцентной иммунолокализацией CENP-ACnp1. Красные сигналы не в самом соседстве с зелеными представляют теломеры или mat2-mat3. Все нентромеры собраны в кластер на периферии ядра рядом с организующим центром митотического веретена

Центромерные районы не полностью лишены генов, и любопытно, что несколько генов тРНК находятся между внешними повторами и центральным кинетохорным районом (рис. 6.2а) (Kuhn et al., 1991; Takahashi et al., 1991). Недавно было показано, что они действуют как барьер, предотвращая вторжение гетерохроматина в центральный домен (Scott et al., 2006).

Зависимый от Clr4 «молчащий» хроматин собирается не только в центромерах, но и над районом размером около 20 т.о., содержащим «молчащие» локусы типа спаривания ( mat2-mat3 ) (Noma et al., 2001) и соседствующим с терминальными теломерными повторами (консенсус TTACAGG), добавляемыми теломеразой (Nimmo et al., 1994, 1998; Allshire et al., 1995; Kanohetal., 2005). Район cenH (т.е. гомологичный центромере), который находится "Между mat2 и mat3 , имеет большое сходство, свыше ~7 т.о., с внешними повторами, обнаруживаемыми в центромерах (Grewal and Klar, 1997). Кроме того, по крайней мере 0.5 т.о. нуклеотидных последовательностей ДНК, имеющих >84 % идентичности с повторами cenH, могли бы действовать в cis -конфигурации, осуществляя сборку «молчащего» хроматина.

Сборка зависимого от Clr4 «молчащего» хроматина происходит даже на соседних маркерных генах, когда центромерный внешний повтор ( dg ) или нуклеотидные последовательности mat2-mat3 (cenH) вставляются в районы генома, где в норме сайленсинг не происходит («эктопический» сайленсинг; рис. 5) (Ayoub et al., 2000; Partridge et al., 2002; Volpe et al., 2003). Простое объяснение могло бы заключаться в том, что связывающиеся с ДНК белки узнают эти повторы и, когда связываются, эти белки рекрутируют HDACs и HKMT Clr4, результатом чего является метилирование H3K9, связывание хромодоменных белков и формирование гетерохроматина. Однако ситуация на самом деле еще более сложная. Теперь известно, что центромерные внешние повторы транскрибируются. Замечательно, что эта транскрипция приводит к образованию двухнитчатой РНК (dsRNA) — субстрата для RNAi-машинерии, — а она затем рекрутирует Clr4 HKMT для включения сборки «молчащего» хроматина (Volpe et al., 2002; Sadaie et al., 2004). RNAi также действует на родственные повторы cenH, обнаруживаемые в районе mat2-mat3 и в повторах TAS в теломерах (Cam et al., 2005; Kanoh et al., 2005).

Рис. 6.5.Нуклеотидные последовательности центромерных повторов опосредуют сайленсинг

Вставка фрагментов (1—2 т.о.) рядом с экспрессируемым геном ura4+ в локусе, который в норме не склонен к сайленсингу, приводит к метилированию НЗК9, связыванию Swi6 и Chp1 и транскрипционному сайленсингу

Однако картина еще более усложняется тем обстоятельством, что в mat2-mat3 RNAi действует, устанавливая «молчащий» хроматин, в то время как связывающиеся с ДНК белки Arf1 и Perl связываются вблиз cenH и поддерживают «молчащий» хроматин над mat2-mat3 даже в отсутствие ключевых компонентов RNAi (Jia et al., 2004; Kim et al., 2004). Аналогично этому, перекрывающиеся механизмы сайленсинга действуют и в теломерах; терминальные повторы без посторонней помощи могут рекрутировать Clr4 HKMT и. таким образом, Swi6 через связывающийся с теломерными повторами белок Tazl, но RNAi действует также через cenH-часть элементов TAS, формируя расширенный район «молчащего» хроматина в теломерах (Nimmo et al., 1994; Allshire et al., 1995; Kanoh et al., 2005). Существует ли сравнимый перекрывающийся механизм для поддержания «молчащего» хроматина в центромерах? Хотя в клетках, лишенных RNAi, сайленсинг репортерных генов внешних повторов и самих транскриптов центромерных внешних повторов является дефектным, H3K9me2 сохраняется на хроматине внешних повторов в отсутствие компонентов RNAi (Sadaie et al., 2004). Какие факторы отвечают за поддержание этого метилирования? Одна возможность заключается в том, что белки, родственные CENP-B (Abpl, Cbhl, Cbh2), содержащие консервативный связывающийся с ДНК домен, связываются с ДНК центромерных повторов и являются необходимыми для эффективного формирования «молчащего» хроматина (Irelan et al., 2001; Nakagawa et al., 2002) Другие наблюдения показывают, что HDAC Clr4 также действует независимо от RNAi, поддерживая целостность гетерохроматина (Yamada et al., 2005).

Феномен RNAi был впервые открыт у Caenorhabditis elegans, где было найдено, что результатом экспрессии dsRNA является утрата экспрессии гомологичного гена. Вскоре стало очевидным, что эта форма RNAi связана с процессом транскрипционного сайленсинга генов (TGS), описанного у растений, и подавлением [quelling] у N. crassa (описывается ниже).

У растений и многоклеточных животных известно, что dsRNA, будучи подвергнута процессингу с помощью машинерии RNAi, дает малые РНК, которые осуществляют модификации ДНК и (или) хроматина на гомологичном хроматине. Наличие у дробянковых дрожжей ортологов основных компонентов пути RNAi, т.е. Argonaute (Ago1), Dicer (Dcrl) и РНК-зависимой РНК-полимеразы (Rdpl), стимулировало их исследование у этих организмов (Volpe et al., 2002), что привело к значительным успехам в понимании опосредованных RNAi модификаций хроматина и сайленсинга.

Фенотипические последствия утери функции Ago1, Dcr1 или Rdpl сходны с таковыми у мутантов swi6: пониженное содержание H3K9me2 и потеря сайленсинга над внешними повторами центромер (рис. 6.36). Однако у мутантов по RNAi были выявлены перекрывающиеся некодирующие РНК-транскрипты (ncRNA) дискретной величины, происходящие с центромерных внешних повторов. Эти ncRNA гомологичны естественно встречающимся малым РНК, называемым короткими интерферирующими РНК (siRNAs; ~21 н.), которые изолированы и секвенированы у S. pombe (Reinhart and Bartel, 2002; Cam et al., 2005). Эти siRNAs генерируются Dicer (компонентом RNAi) посредством расщепления двунитчатых дериватов гомологичных некодирующих транскриптов длинного центромерного повтора [mediated by cleavage of the double-stranded derivatives of the long centromere repeat homologous noncoding transcripts].