Чарльз Эллис - Эпигенетика

RIP был открыт в результате детального анализа потомства от скрещиваний трансформантов Neurospora (Selker 1990). Обратили внимание на то, что дуплицированные последовательности — как нативные, так и чужеродные, как сцепленные, так и несцепленные — подвержены многочисленным поляризованным мутациям типатранзиций (G:C в А:Т) в гаплоидных геномах специальных двухъядерных клеток, получающихся в результате оплодотворения (рис. 6.12). Эксперименты, в которых стабильность гена тестировали, когда он был один в геноме или в комбинации с несцепленным гомологом, показали, что RIP не просто ассоциирован с повторами; он действительно индуцируется повторами. В дуплицированных последовательностях в одном пассаже с половым циклом могут мутировать примерно до 30 % пар G:C. Нередко (но не всегда) последовательности, измененные RIP, становятся метилированными de novo. Вполне вероятно, что мутации, индуцированные RIP, происходят путем ферментативного дезаминирования 5-meС или путем дезаминирования С, сопровождающегося репликацией ДНК (Selker, 1990). Метилирование цитозинов включает образование промежуточного соединения, склонного к спонтанному дезаминированию; это заставляет предполагать, что этап RIP, связанный с предполагаемым дезаминированием, мог бы катализироваться DMT или DMT-подобным энзимом. С этой возможностью согласуется тот факт, что один из двух гомологов DMT, предсказанных по геномной последовательности Neurospora, участвует в RIP (Freitag et al., 2002). Потомство от гомозиготных скрещиваний мутантов с дефектами в этом гене, rid (RIP defective), не дает новых случаев RIP. Мутанты rid не обнаруживают сколько-нибудь заметных дефектов в метилировании ДНК, фертильности, росте или развитии. Напротив, второй гомолог DMT у Neurospora (DIM-2), который был идентифицирован генетически и который, как было показано, необходим для всех известных видов метилирования ДНК, не требуется для RIP (Kouzminova and Selker, 2001).

Рис. 6.12.Мутации от RIP и статус метилирования восьми аллелей am

Вертикальными линиями обозначены мутации. Аллели, изображенные черным цветом, были неметилированными, аллели, изображенные синим, были первоначально метилированными, но, после того, как с помощью 5-азацитидина или путем клонирования и замещения гена была индуцирована утрата метилирования, не стали реметилированными. Аллели, изображенные красным цветом, были не только изначально метилированы, но и включали метилирование de novo (из Singer et al., 1995, с изменениями)

Все указывает на то, что каждая дупликация достаточной величины (больше чем ~400 п.н. для тандемной дупликации или -1000 п.н. для несцепленной дупликации) подвержена RIP в некоторой доле специальных двухъядерных клеток. Тем не менее, дупликации с некоторой частотой (обычно менее 1 % для тандемной дупликации или -50 % для несцепленной дупликации) избегают RIP. Даже дупликации хромосомных сегментов, содержащих многочисленные гены, чувствительны к RIP (Perkins et al., 1997; Bhat and Kasbekar, 2001). Хотя RIP ограничен половой фазой жизненного цикла, существование этого процесса ставит вопрос о том, может ли Neurospora использовать дупликации генов для эволюции. В геномной последовательности обнаружили семейства генов, но практически все паралоги, как оказалось, достаточно дивергировали, чтобы не включать RIP (Galagan and Selker, 2004). Мы приходим к заключению, что RIP действительно может ограничивать эволюцию у Neurospora. Интересно, что некоторые грибы демонстрируют то, что, по-видимому, является мягкими системами защиты генома, сходными с RIP. Наиболее заметный пример — премейотически индуцируемое метилирование (MIP), процесс, выявляющий сцепленные и несцепленные дупликации последовательностей в период между оплодотворением и кариогамией подобно RIP, но зависящий для инактивации исключительно от метилирования ДНК; в последовательностях, инактивированных MIP, не было обнаружено никаких свидетельств мутаций (Rossignol and Faugeron 1994).

Обнаружение того, что одна DMT, а именно DIM-2, ответственна за все выявляемое метилирование ДНК, было столь же удивительным, как и первоначальное обнаружение безудержного Irampant] метилирования в несимметричных сайтах у Neurospora, поскольку ни для одной ранее идентифицированной DMT не было известно, чтобы она метилировала цитозины в разнообразных по последовательности контекстах. Очевидный, но важный вопрос заключался в следующем: обязательно ли метилирование в несимметричных сайтах отражает потенциальную способность соответствующих последовательностей индуцировать метилирование de novo? Ранние опыты по трансформации не противоречили такой возможности; метилированные последовательности, лишенные их метилирования (например, с помощью клонирования), вновь обретали свое нормальное метилирование, будучи реинтродуцированы в вегетативные клетки. С сюрпризом столкнулись, однако, когда восемь аллелей гена ат, сгенерированных RIP, были протестированы на их способность индуцировать метилирование de novo (Singer et al., 1995). Некоторые продукты RIP с относительно немногочисленными мутациями (рис. 6.12, am RIP3 и am RIP4 ) не сделались реметилированными, даже в своем нормальном локусе; это позволяло предположить, что наблюдаемое метилирование представляло собой воспроизведение метилирования, установленного ранее. Важно отметить, что их метилирование, подобно другому метилированию, наблюдаемому у Neurospora, не было ограничено симметричными сайтами, не распространялось сколько-нибудь существенно с течением времени и было «гетерогенным» в том смысле, что паттерн метилированных остатков не был инвариантным в пределах клональной популяции клеток. Таким образом, это метилирование, хотя и зависимое от предшествовавшего метилирования, установленного в половой фазе (вероятно, с помощью RIP), могло не отражать действие «поддерживающей метилазы» того типа, который предполагался в оригинальной модели наследования паттернов метилирования. Заслуживает внимания, что MIP у Ascobolus , результатом которого также является гетерогенное метилирование, представляет первое доказательство воспроизведения метилирования ДНК у грибов (Rossignol and Faugeron, 1994). Способность Neurospora осуществлять поддерживающее метилирование была подтверждена экспериментально (Selker etal., 2002). Интересно, что воспроизведение метилирования оказалось сиквенс-специфичным (т.е. оно работает не на всех последовательностях), что добавляет новое измерение к концепции поддерживающего метилирования Хотя можно представить себе ряд возможных схем, результатом которых будет воспроизведение метилирования ДНК, действительный механизм, работающий у Neurospora, остается неизвестным. В принципе, поддержание метилирования в несимметричных сайтах могло бы зависеть от метилирования близлежащих симметричных сайтов, но наблюдаемое гетерогенное метилирование, включая сайты CpG, делает этот вариант маловероятным. Механизмы обратной связи с участием белков, ассоциированных с метилированной ДНК, могли бы приводить к метилированию, зависящему от предсуществующего метилирования, т.е. к поддерживающему метилированию. Как обсуждается ниже, данные, полученные на Neurospora (и других организмах), означают участие модификаций гистонов в контроле метилирования ДНК, указывая тем самым на возможную роль гистонов в поддерживающем метилировании