Чарльз Эллис - Эпигенетика

У Tetrahymena каноническая модификация гетерохроматина, H3K9-метилирование, маркирует хроматин, связанный с IESs, непосредственно перед их вырезанием. Каким образом эта модификация осуществляет специфическое «нацеливание» на эти сегменты ДНК, предназначенные для элиминации? Был описан RNAi-подобный путь, который использует RNA-гиды, чтобы направить ее на соответствующие локусы (обзор см. Mochizuki and GorovskY, 2004; Yao and Chao, 2005). Первоначальным указанием на то, что делеция ДНК использует молекулы гомологичных РНК, явилось наблюдение, что у Tetrahymena IESs двунаправлено транскрибируются на ранних этапах конъюгации (Chalker and Yao, 2001). Реальный прорыв случился, когда Mochizuki и др. (2002) идентифицировали белок семейства PIWI/Argonaute, кодируемый геном TWI1 , который экспрессируется в ходе развития и необходим для перестройки ДНК (Mochizuki et al., 2002) Поскольку белки Argonaute являются ключевыми игроками в процессах, включаемых RNAi, эти исследователи искали и нашли такой класс эндогенных малых (-28 нуклеотидов) РНК, которые предпочтительно комплементарны к последовательностям, ограниченным зародышевой линией. Деструкция гена TWI1 дестабилизировала эти короткие РНК и ликвидировала метилирование H3K9 в развивющемся соматическом ядре. Эта работа, опубликованная в 2002 году, в совокупности с экспериментами на Schizosaccharomyces pombe (главы 6 и 8) утвердила новую парадигму, согласно которой

гетерохроматин генерируется действием гомологичных РНК, «нацеливающих» метку сайленсинга (H3K9) на специфичные локусы.

Характеристика гена DCLl, кодирующего рибонуклеазу Dicer, осуществляющую процессинг двусторонних транскриптов в ~28-нуклеотидные малые РНК, обеспечила еще более глубокое проникновение в общую регуляцию этого процесса (Malone et al., 2005; Mochizuki and Gorovsky, 2005). Этот белок экспрессируется на высоком уровне на ранних этапах конъюгации и локализуется в премейотических микронуклеусах, что указывает на то, что генерация малых РНК компартментализована во времени и пространстве в пределах этого ядра зародышевого пути. Разрушение гена DCL1 вызывало утрату способности производить малые РНК, аккумуляцию транскриптов зародышевой линии и, в конечном счете, неспособность к вырезанию IES. Интригующим моментом является то, что утрата малых РНК не ликвидирует метилирование H3K9, как это наблюдалось в линиях с нокаутом по TWI1. Тем не менее, анализ с помощью иммунопреципитации хроматина показал, что эта модификация больше не является обогащенной на IESs; таким образом, малые РНК необходимы для того, чтобы «нацеливать» эту модификацию хроматина на нужные локусы (Malone et al., 2005).

Чтобы объяснить роль материнского генома в регуляции этих событий, была предложена модель сканирующей РНК (Mochizuki et al., 2002). В варианте этой модели, изображенном на рис. 7.9, 28-нуклеотидные «сканирующие» РНК, генерируемые в микронуклеусе, - связываются с RISC-подобным комплексом в цитоплазме, содержащим Twil, и изначально направляются в материнский макронуклеус. Здесь они сканируют существующий перестроенный геном на наличие гомологии. Те scnRNAs, которые спариваются с материнскими последовательностями, удаляются из пула активных комплексов. Остающиеся scnRNAs, ассоциированные с Twil, транспортируются затем в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» метилирование H3K9 на гомологичные последовательности, маркируя их для вырезания с помощью механизма перестройки ДНК. Эта модель подкрепляется далее наблюдением, согласно которому Twil локализуется в материнском макронуклеусе на ранних этапах развития после образования основной массы малых РНК, но до появления предшественников новых макронуклеусов. Таким образом, регулируемый трафик комплексов малых РНК и белков облегчает сравнение соматического генома и генома зародышевой линии.

Для сравнения последовательностей зародышевой линии и соматических в масштабах всего генома был бы необходим весьма сложный механизм, как для обеспечения массивного транспорта молекул РНК между ядрами, так и для осуществления очень большого числа взаимодействий по механизму спаривания, которые предполагаются в модели сканирования. Участником этих транс -нуклеарных «переговоров» у Paramecium оказался новый белок, Nowal, связывающийся с нуклеиновой кислотой (Nowacki et al., 2005). Nowal синтезируется незадолго до мейоза и сначала аккумулируется в материнском макронуклеусе, а затем, подобно Twil Tetrahymena , релокализуется в развивающийся зиготический макронуклеус. Мечение Nowal фотоактивируемым GFP позволило исследователям убедительно продемонстрировать, что этот белок транспортируется из ядер одного типа в ядра другого. Один домен этого белка может связывать РНК, а второй домен необходим и достаточен для межъядерного транспорта; таким образом, Nowal может быть транспортером РНК.

Nowal является существенным для развития жизнеспособного нового макронуклеуса, в том числе для элиминации транспозонов зародышевой линии и подгруппы IESs. Удивительно, но только те IESs, которые подвержены материнскому контролю, затрагиваются нокдауном Nowal; это позволяет предполагать, что этот белок участвует в trans -нуклеарном сопоставлении. Те IESs, которые нечувствительны к присутствию гомологичных последовательностей в материнском макронуклеусе, не зависят в своей эксцизии от Nowal, что подтверждает существование механистически различных классов IESs у Paramecium. Хотя нуклеиновые кислоты, связываемые Nowal in vivo, пока еще не известны, эффекты удаления Nowal согласуются с предлагаемой моделью сканирования (рис. 7.9) и позволяют предполагать, что этот белок может нести РНК, отобранные для «нацеливания» элиминации находящихся под материнским контролем IESs и транспозонов в развивающемся макронуклеусе.

Рис. 7.9.Модель сканирования РНК, объясняющая контроль делеции ДНК

Двунаправленная транскрипция большой части генома зародышевой линии происходит на ранних этапах развития и приводит к продукции scnRNAs. Эти РНК затем транспортируются в материнский макронуклеус, где любая встреча с гомологичной последовательностью включает их удаление из активного пула. Остающиеся, микронуклеус-специфичные РНК перенаправляются в развивающийся макронуклеус, где они «нацеливают» НЗК9-метилирование на гомологичные последовательности, создавая сигнал об их удалении из генома. Модель адаптирована из: Mochizuki et al. (2002)

Исследования RNAi, в особенности у растений и нематод, привели к гипотезе, что этот путь развился как защитный механизм, позволяющий клеткам контролировать пролиферацию вирусов и транспозонов путем разрушения mRNAs и «нацеливания» формирования гетерохроматина на этих геномных паразитах (Matzke and Birchler, 2005). Как уже упоминалось, перемещающиеся элементы, присутствующие в геноме зародышевой линии инфузорий, элиминируются в ходе развития соматического макронуклеуса, что эффективно сводит на нет их влияние. Сделанное на Tetrahymena наблюдение, что метилирование H3K9 маркирует геномные районы для делеции ДНК в ходе развития, заставляет предполагать, что использование RNAi у инфузорий в основе своей сходно с его ролью в формировании гетерохроматина у других эукариот: инфузории лишь продвинулись на шаг дальше и элиминируют гетерохроматин из своего соматического генома. Тем не менее, одним оригинальным вкладом, полученным в исследованиях на инфузориях, является идея о том, что специфические последовательности, «предназначаемые» RNAi для формирования (элиминации) гетерохроматина в ходе раннего развития, селектируются с помощью глобального сопоставления материнских соматического генома и генома зародышевой линии, начинающегося во время мейоза. Этот механизм эффективно защищал бы от вредоносных влияний транспозиции в зародышевой линии: любой новый транспозон, интегрирующийся в материнскую зародышевую линию, распознавался бы как чужеродный путем сравнения с соматическим геномом в ходе полового воспроизведения, что вело бы к его удалению из транскрибированного соматического генома потомков, ограничивая тем самым его будущее распространение.