Чарльз Эллис - Эпигенетика

Если ассоциированные с сайленсингом siRNAs направляют ДНК-перестройки, тогда введение dsRNA до начала или во время развития должно стимулировать элиминацию гомологичной последовательности в потомстве. Чтобы это проверить, клеткам Paramecium , которым скармливались E.coli штамма, продуцирующего dsRNA, гомологичную кодирующей последовательности ND7 — гену, участвующему в регулируемом экзоцитозе секреторных пузырьков, называемых трихоцистами, — дали возможность пройти автогамию и развить новые макронуклеусы из микронуклеусов дикого типа. Некоторое число поставтогамных потомков продемонстрировали мутантный фенотип ND7 благодаря элиминации этого гена из их макронуклеусов (Gamier et al., 2004). Даже потомство фенотипически дикого типа показало частичную элиминацию копий гена ND7. Как и~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с трансген-индуцированным сайленсингом, ~23-нуклеотидные siRNAs, связанные с кормлением dsRNA, сохранялись, как было показано, в этих клетках на протяжении всей аутогамии (Nowacki et al., 2005), подтверждая их участие в «нацеливании» постзиготических делеций. Явление индуцированной ДНК делеции, направляемой dsRNA, не ограничивается Paramecium. Микроинъекция конъюгирующим Tetrahymena смысловой и антисмысловой РНК, транскрибированной in vitro и гомологичной геномным локусам, в норме сохраняющимся в макронуклеусе, приводит к неточной делеции этих последовательностей (Yao et al., 2003).

Хотя перестройки, индуцируемые трансгенами и dsRNA, иллюстрируют эпигенетическую природу процесса элиминации ДНК, возможно еще более удивительными являются наблюдения, что паттерны индуцированных перестроек могут наследоваться в последовательных раундах макронуклеарного развития. Первое доказательство эпигенетической регуляции перестроек было обнаружено, когда аберрантная делеция из макронуклеуса гена, кодирующего у P.tetraurelia поверхностный антиген А , оказалась цитоплазматически наследующейся в скрещиваниях с диким типом (рис. 7.7) (Epstein and Fomey, 1984). В макронуклеусах дикого типа ген А локализован вблизи конца хромосомы на расстоянии 8,13 либо 26 тн от теломеры, что диктуется тремя альтернативными сайтами фрагментации. Было обнаружено, что вариантная клеточная линия, называемая d48, не экспрессирует ген А, потому что сам этот ген был утерян вместе со всеми последовательностями «вниз по течению», когда формировалась его теломера на 5’-конце этого гена (Fomey and Blackburn, 1988). Эксперименты по трансплантации ядер подтвердили, что микронуклеус зародышевой линии d48 несёт ген А дикого типа. Например, замена микронуклеуса d48 микронуклеусом штамма дикого типа не предотвращает материнской передачи делеции гена А половому потомству; и наоборот, микронуклеус d48, будучи трансплантирован в клетку дикого типа, давал начало после автогамии новому макронуклеусу, который содержал ген A (Harumoto, 1986; Kobayashi and Koizumi, 1990). Сходные эксперименты, сфокусированные на поддержании или делеции еще одного проксимального по отношению к теломере гена поверхностного антигена, гена В , показали, что такие материнские эффекты могут наблюдаться и в других районах генома (Scott et al., 1994). В совокупности эти исследования заставляют предполагать, что некий геномный район должен присутствовать в материнском макронуклеусе для того, чтобы эффективно сохраняться и амплифицироваться в развивающемся макронуклеусе до числа копий, характерного для дикого типа.

Рис. 7.7.Эпигенетическое наследование и экспериментальное «спасение» делеций макронуклеарного гена А

( а ) Штамм дикого типа. ( б ) У штамма d48 нет гена А в его макронуклеусе, но его микронуклеус — дикого типа. Ген А воспроизводимо делетируется в ходе развития макронуклеуса в каждом поколении, ( в ) Трансформация макронуклеуса штамма d48 последовательностями гена А специфически восстанавливает амплификацию гена А зародышевой линии в развивающемся макронуклеусе полового потомства

Материнское влияние на перестройки ДНК. подобное тому, как это наблюдалось для d48, по-видимому контролирует развитие многих, а возможно и всех, районов макронуклеарного генома Paramecium. В самом деле, макронуклеарные делеции, создаваемые экспериментально в половом потомстве, могут «спонтанно» воспроизводиться в последующих половых поколениях, по материнскому типу наследования. Это наблюдали и для делеций гена G, индуцированных у Pprimaurelia высококопийным трансгеном, для другого субтеломерного гена поверхностного антигена (Меуег, 1992), и для макронуклеарных делеций гена ND7, которые превоначально были индуцированы скармливанием dsRNA (Gamier et al., 2004). В любом случае индуцирующий трансген или введенная dsRNA не были больше необходимыми для воспроизведения данной делеции в половом потомстве. У d48 и в этих индуцированных вариантных клеточных линиях данное состояние соматического генома может время от времени после автогамии ревертировать к перестроечному паттерну дикого типа, подтверждая тем самым, что этот ген все еще наличествует в микронуклеарном геноме, и высвечивая эпигенетический способ наследования.

Замечательно, что сайленсинг гена и подучающаяся в результате делеция ДНК могут «запоминаться» в последующих поколениях; при этом целевой геномный район обрабатывается в ходе развития макронуклеуса так же, как транспозоны и IESs. Рекуррентная делеция гена в каждом половом поколении, по-видимому, не индуцируется ~23-нуклеотидными siRNAs, поскольку эти РНК выявлялись лишь тогда, когда сайленсинг экспериментально индуцируется в первом поколении. Более того, генетический анализ таких клеточных линий показал, что этот микронуклеарный ген не несет никакого постоянного импринта, поскольку он может нормально амплифицироваться в ходе макронуклеарного развития, когда он переносится при конъюгации в клеточную линию с макронуклеусом дикого типа. Создается, следовательно, впечатление, что этот ген делегируется в развивающемся макронуклеусе просто потому, что он отсутствует в материнском макронуклеусе.

Воспроизведение материнских перестроечных состояний позволяет предполагать, что геном зародышевой линии, которому предстоит реорганизация, сравнивается с существующим перестроенным геномом, и последовательности, отсутствовавшие в предшествующем поколении, делаются целевыми для удаления из вновь формирующегося соматического генома. Если бы это действительно было так, то можно было бы предсказать, что трансгены, интродунируемые в микронуклеус зародышевой линии, часто делегировались бы в ходе развития нового макронуклеуса. У Tetrahymena , где была разработана трансформация микронуклеуса, исследователи наблюдали, что интегрированные маркеры лекарственной устойчивости, используемые для исследований с дизрупцией генов, могут делегироваться из макронуклеарного генома в ходе последовательных раундов конъюгации (Yao et al., 2003; Liu et al., 2005). Геномная локализация трансгена, а также число копий, вводимых в геном зародышевой линии, существенно влияли на эффективность элиминации (Liu et al., 2005), что указывает на то, что индукция данного явления у этой инфузории носит менее общий характер. Тем не менее, эти результаты демонстрируют, что чужеродная последовательность, бактериальный неоген, может распознаваться клеткой как IES.