Чарльз Эллис - Эпигенетика

Двунитевая РНК (dsRNA) является вероятным первичным триггером для индуцируемого трансгеном сайленсинга, наблюдаемого у Paramecium. Сайленсирующая эффективность трансгенов коррелирует с образованием аберрантных молекул РНК, соответствующих как смысловой, так и антисмысловой нитям инъецированной последовательности. Более того, способность dsRNA стимулировать сайленсинг гена была продемонстрирована путем скармливания клеткам Paramecium бактерий Escherichia coli, экспрессирующих dsRNA клонированного гена, с использованием методологии, разработанной для Caenorhabditis elegans (Timmons and Fire, 1998; Timmons et al., 2001). Сайленсинг эндогенного гена можно наблюдать фенотипически спустя всего три вегетативных деления, т.е. меньше чем через 24 часа (Galvani and Sperling, 2002). Скармливание убитых нагреванием E.coli цнфузориям-спиротрихам, в норме питающимся водорослями, также индуцирует генный сайленсинг (Pashka et al., 2003), заставляя предполагать, что многие разные инфузории обладают этим механизмом. У Paramecium молекулярный анализ показал, что кормление dsRNA приводит к накоплению таких же -23-нуклеотидных siRNAs, какие наблюдаются после сайленсинга, индуцируемого трансгеном (Nowacki et al., 2005); это указывает, что оба эти явления базируются на общем RNAi-пути.

Сайленсинг, индуцируемый у Paramecium скармливанием dsRNA, может быть немедленно ревертирован замещением E.coli в культуральной среде нормальными пищевыми бактериями; аналогичным образом прямая микроинъекция dsRNA в цитоплазму индуцирует лишь временный, преходящий сайленсинг гомологичных генов, предположительно потому, что инъецированная dsRNA быстро разбавляется в ходе вегетативного роста (Galvani and Sperling, 2002). Эти наблюдения позволяют предположить, что молекулы dsRNA не могут быть амплифицированы до сколько-нибудь значительного уровня в цитоплазме вегетативных клеток, в отличие от судьбы dsRNA в С.elegans, где это может приводить к наследуемому сайленсированному состоянию. Это, далее, предполагает, что RNAi у Paramecium не приводит к установлению стабильного транскрипционного сайленсинга гена в макронуклеусе. Наследуемый сайленсинг, вероятно, требовал бы метилирования гистона H3K9. А, как упоминалось выше, эта модификация, очевидно, отсутствует в вегетативном макронуклеусе, по крайней мере у Т. thermophila.

Во время развития инфузории три разных генома должны различаться и канализироваться по трем раздельным направлениям: микронуклеарный геном зародышевой линии должен сохраняться интактным, в то время как развивающийся соматический геном в новом макронуклеусе направляется таким образом, чтобы подвергнуться экстенсивной реорганизации; материнский же соматический геном обречен на разрушение. В этих более широких рамках цель исследователей, работающих на инфузориях, заключалась в том, чтобы понять воспроизводимость паттернов ДНК-перестроек. Первоначальные усилия были направлены на то, чтобы идентифицировать ds-активные мотивы ДНК-последовательностей, которые могли бы рекрутировать рекомбинационные белки, но поиски дали мало четких результатов (см.: Yao et al., 2002; Betermier, 2004). Первичная ДНК-последовательность определенно не является единственным детерминантом, направляющим реорганизацию макронуклеарного генома, — вывод, подкрепляемый данными о том, что H3K9-метилирование маркирует сегменты ДНК для элиминации. Более того, многие паттерны перестроек, как описано ниже, чувствительны к зависящим от гомологии эффектам, что делает возможным наследование альтернативных паттернов по материнской линии в последующих половых поколениях, независимо от Менделевской передачи генома дикого типа зародышевой линии Наследование паттернов перестройки удовлетворяет, следовательно, определению эпигенетического явления.

Еще до того как посттранскрипционный сайленсинг генов был описан у Paramecium , было обнаружено, что введение клонированных последовательностей в большом числе копий в вегетативный макронуклеус изменяет ДНК-перестройки в половом потомстве трансформированных клонов. Удивительно, что последовательности, гомологичные трансгену, специфическим образом делегировались по неточному механизму, в то время как микронулеарный геном оставался интактным (рис. 7.6) (Meyer, 1992). Это явление, по-видимому, было весьма общим, поскольку все испытанные фрагменты ДНК могли производить делеции (Meyer et al., 1997). Эти эксперименты показывали, что в ходе половых событий сиквенс-специфичная информация передается через цитоплазму из трансформированного материнского макронуклеуса в развивающийся зиготический макронуклеус. Эта всеобщность данного эффекта говорила не в пользу тех трактовок, в которых роль отводилась сиквенс-специфичным ДНК-связывающим белкам, продуцируемым или титруемым инъецированными трансгенами. Наиболее экономное объяснение, согласующееся с наблюдаемой специфичностью, предполагает, что нуклеиновые кислоты, предположительно молекулы РНК, переносятся между ядрами и распознают свои мишени на основе взаимодействий, базирующихся на спаривании.

Рис. 7.6.Индуцированные трансгеном делеции у Paramecium

( а ) У дикого типа ген А ( красные стрелки ) расположен вблизи гетерогенных концов макронуклеарной хромосомы; розовые прямоугольники = макронуклеарные теломеры. Паттерн перестроек макронуклеарной хромосомы надежно репродуцируется в ряду поколений, ( б ) Введение большого числа копий трансгенов А в материнский макронуклеус может индуцировать полную делецию эндогенного гена А в половом потомстве, когда новый макронуклеус развивается из производного зародышевой линии дикого типа. Новые макронуклеарные теломеры располагаются непосредственно «вверх по течению» от гена А

Конструкты, которые эффективно индуцируют постзиготические делеции, являются неэкспрессибельными трансгенами, такими как трансгены, содержащие мутации типа сдвига рамки считывания или усечения 5’ или 3’ UTRs (Gamier et al., 2004). Те из них, которые могут продуцировать стабильные, способные транслироваться иРНК, не стимулируют элиминацию гомологичных генов из развивающихся макронуклеусов. Те же конструкты, которые стимулируют делецию ДНК, вызывают также сайленсинг эндогенных материнских генов в ходе вегетативного роста трансформированных клонов. Таким образом, постзиготические делеции коррелируют с презиготическим сайленсингом и с накоплением ~ 2 3 - нукл еотид н ых siRNAs. Эти siRNAs, как было показано далее, сохраняются в клетках на протяжении всего развития, что заставляет предполагать, что они могут отвечать за включение этих делеций.