Чарльз Эллис - Эпигенетика

Во время развития макронуклеуса хромосомы, происходящие из зародышевой линии, фрагментируются на более короткие молекулы, которые кепируются добавлением de novo теломерных повторов (рис. 7.5). Получающиеся в результате этого макронуклеарные хромосомы, по всей видимости, не имеют центромер, и таким образом хромосомная фрагментация может облегчать равное распределение этих молекул при амитотических делениях макронуклеуса. Степень фрагментации широко варьирует у разных видов. У спиротрих фрагментация достигает крайней степени, давая крошечные «нанохромосомы», обычно содержащие по одному гену, тогда как у Paramecium и Tetrahymena макронуклеарные хромосомы варьируют по размеру от 20 Кб до более чем 1 Мб и содержат по много генов.

У большинства инфузорий этот процесс является неточным, так что точное положение добавления теломерных повторов оказывается гетерогенным и часто приводит к некоторым потерям последовательностей зародышевой линии. Одно из исключений — Euplotes crassus , у которого теломеры всегда добавляются в одних и тех же нуклеотидных позициях (Klobutcher, 1999). У Tetrahymena консервативная последовательность хромосомного разрыва длиной 15 пн (CBS), обнаруженная в 280 локусах хромосом зародышевой линии (Cassidy-Hanley et al., 2005; Hamilton et al., 2005), является и необходимой, и достаточной для направления фрагментации и добавления новых теломер (Fan and Yao, 1996). Напротив, у видов P. aurelia никаких аналогичных CBS не было идентифицировано. Скорее, все данные показывают, что фрагментация хромосом является альтернативным результатом неточных делеций (рис. 7.5); при таких делециях элиминация ДНК залечивается либо путем воссоединения фланкирующих последовательностей, либо путем добавления теломер (Le Моил1 et al., 2003).

Хотя геномные перестройки инфузорий исследуются более 30 лет, молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий, остаются в основном неизвестными (Yao et al., 2002). Частично задачей, стояшей перед исследователями, было объяснить разнообразие событий, которые наблюдаются у разных инфузорий. Для нескольких инфузорий были описаны эксцизионные интермедиаты, а также (побочные) продукты циркулярной эксцизии (Jaraczewski and Jahn, 1993; Klobutcher et al., 1993; Williams et al., 1993; Saveliev and Cox, 1995, 1996; Betermier et al., 2000; Gratias and Betermier, 2003). Эти данные не позволяют вывести единый механизм эксцизии даже для тех IESs разных инфузорий, которые имеют на своих концах сходные консенсусные последовательности (см. Klobutcher and Herrick, 1995; Gratias and Betermier, 2001; Betermier, 2004).

Несмотря на разнообразие механизмов эксцизии может все же иметь место значительное перекрывание в событиях, направляющих перестройки ДНК. Одной из общих черт является то, что транспозоноподобные и повторяющиеся последовательности элиминируются, по-видимому, преимущественно. Как описывается в этой книге, одна из ролей эпигенетических механизмов заключается в том, чтобы подавлять активность этих потенциально вредоносных ДНК-элементов. Разрешение для транспозона переместиться из «молчащей» зародышевой линии в высоко активный макронуклеус является потенциально гибельным для соматического генома. Многие и разнообразные данные указывают на механизмы, связанные с RNAi и формированием гетерохроматина, как на участников этих процессов перестроек ДНК (Mochizuki and Gorovsky, 2004; Yao and Chao, 2005).

У большинства эукариот гистон H3, метилированный по лизину 9 (H3K9me), в значительной степени ассоциирован с репрессированной ДНК, вычленяемой в ядре как гетерохроматин (см. раздел 7 главы 3). У Tetrahymena эта модификация не обнаруживается в транскрипционно «молчащем» микронуклеусе, как можно было бы предположить, но обнаруживается исключительно в развивающихся макронуклеусах непосредственно перед перестройками ДНК или одновременно с ними (Taverna et al., 2002). Эксперименты по иммунопреципитации хроматина показали, что этой модификацией обогащены гистоны, связанные с IESs. Элиминация ДНК и формирование гетерохроматина были первоначально сцеплены друг с другом в результате идентификации хромодоменсодержащего белка (Pddl — Programmed DNA Degradation 1 protein) — обильно представленного, экспрессируемого в ходе развития белка, колокализующегося в фокусах, содержащих ДНК, ограниченную зародышевой линией и подлежащую элиминации (т.е. IESs) из соматического генома (Madireddi et al., 1994, 1996). Хромодомены — это белковые мотивы, обладающие сродством, способностью связываться с некоторыми остатками метилированных гистонов. Возможно, что архетипическая модель участия хромодоменного белка в регуляции хроматина — это связывание гетерохроматинового белка 1 (НР1 — содержащий хромодомен) с метилированным H3K9 у Drosophila , играющее роль в формировании гетерохроматиновых доменов (детали см в главе 5). Хромодомены Pddl и Pdd3, два белка, требующихся для перестроек ДНК (Coyne et al., 1999; Nikiforov et al., 2002), связываются с пептидами

H3K9me2 (Taverna et al., 2002). Для того чтобы продемонстрировать, что эта модификация хроматина требуется для перестройки ДНК, Лиу, Мочицуки и Горовски [Liu, Mochizuki and Gorovsky] использовали методику гомологичного замещения гена, чтобы заменить гены основного гистона H3 копиями, содержащими мутацию, поменявшую лизин 9 (K9Q) (Liu et al., 2004). Эти клетки не могли эффективно удалять IESs в ходе развития несмотря на тот факт, что Pddl локализовалась соответственно в предшественниках макронуклеусов, показывая тем самым, что H3K9me2 требуется для элиминации ДНК. Из-за того, что установление состояний хроматина является ключевым детерминантом эпигенетической регуляции, важный вопрос заключается в следующем: каким образом метка H3K9me2 специфически нацеливается на сегменты ДНК, обреченные на элиминацию? Как описывается ниже, несколько экспериментов продемонстрировали, что в направлении перестроек ДНК участвуют гомологичные РНК.

Зависящие от гомологии, опосредуемые РНК механизмы сайленсинга широко используются эукариотами для эпигенетической регуляции. Данные о том, что такие механизмы активны у инфузорий, впервые были получены на Paramecium после трансформации вегетативного макронуклеуса неэкспрессибельными трансгенами, которые производят фенокопию менделевских мутантов в эндогенных генах. Сходные эффекты были затем воспроизведены у Paramecium и спиротрих при скармливании клеткам двунитевых РНК, что позволяло предполагать участие механизмов RNAi. Один из этих механизмов ведет к крайней форме сайленсинга генов — элиминации ДНК.

Макронуклеус Paramecium легко трансформировать с помощью микроинъекций, потому что любой введенный в него фрагмент ДНК может поддерживаться в широком диапазоне числа копий, реплицируясь автономно без потребности в каком-либо специфическом ориджине. Трансформация высококопийными, неэкспрессибельными трансгенами может переключить посттранскрипционный сайленсинг эндогенных генов, обладающих достаточным сходством по последовательности (Ruiz et al., 1998; Galvani and Sperling, 2001). Сайленсинг не наблюдается, если в трансгене присутствует 3’UTR гена (Galvani and Sperling, 2001), что заставляет предполагать, что регуляторные сигналы, присутствующие в РНК, влияют на способность конструкта индуцировать сайленсинг. Впоследствии оказалось, что сайленсинг коррелирует с накоплением гомологичных коротких РНК длиной приблизительно 23 нуклеотида (н) (Gamier et al., 2004); это указывает на связь с путем RNAi. Эти короткие РНК длиной -23 н, по-видимому, ответственны за прицельную деградацию гомологичных mRNAs и могут быть поэтому названы siRNAs (short interfering RNAs — короткие интерферирующие РНК). Сходный класс РНК длиной 23—24 н был также идентифицирован в вегетативных клетках Tetrahymena , и хотя какие-либо данные об их возможной роли отсутствуют, вполне вероятно, что они представляют собой эндогенные siRNAs (Lee and Collins, 2006).