Чарльз Эллис - Эпигенетика

Является ли простое отсутствие некоего геномного района в материнском соматическом макронуклеусе достаточным для направления его будущей элиминации? Если это так, тогда повторное введение гена А в макронуклеус d48 должно было бы «спасать» этот дефект в воспроизведении гена А в ходе развития. Сначала было показано, что инъекция либо макронуклеоплазмы дикого типа в вегетативный макронуклеус d48 (Harumoto, 1986), либо цитоплазмы от автогамных клеток дикого типа в клетки d48 в раннем развития (Koizumi and Kobayashi, 1989) приводили к перманентной реверсии d48 к дикому типу. Впоследствии прямая микроинъекция нескольких неперекрывающихся фрагментов гена >4, распространяющихся на большую часть ~8-тн кодирующей последовательности, в макронуклеус d48 продемонстрировала, что последовательность гена А сама по себе достаточна для восстановления макронуклеарного перестроечного паттерна дикого типа (рис. 7) (Koizumi and Kobayashi, 1989; Jessop-Murray et al., 1991; You et al., 1991).

Влияние материнского генома на перестройки ДНК показывает заметную специфичность по последовательности. Кодирующие последовательности генов А и В в целом идентичны на 74 %. Тем не менее, инъекция последовательностей гена А в макронуклеус клеточной линии, несущей макронуклеарные делеции обоих генов, могла лишь предотвращать делению гена А из нового макронуклеуса; и сходным же образом, инъекция гена В могла лишь препятствовать своей собственной делеции (Scott et al., 1994). Кроме того, макронуклеарную делецию d48 нельзя было «спасти» трансформацией геном G от P.primaurelia , на 78 % идентичным с геном А. С другой стороны, макронуклеарная делеция гена А могла быть «спасена» трансформацией другой аллелью гена Л, демонстрирующей 97%-ную идентичность (Forney et al., 1996). Таким образом, материнское «спасение» макронуклеарных делеций является зависящим от гомологии процессом, который не нуждается в какой-либо специфической последовательности внутри генов, но требует некоего минимального уровня идентичности последовательностей.

Этот материнский эффект «спасения» d48, на первый взгляд, выглядит как не согласующийся с индуцированными трансгеном делециями, поскольку в этих экспериментах инъекция последовательностей гена А в материнский макронуклеус имела в точности противоположные последовательности в зиготическом гене А. Этот кажущийся парадокс был разрешен, когда было показано, что постзиготический эффект делеций зависит от установления зависяшего от гомологии сайленсинга в трансформированных клонах (Gamier et al., 2004). Наоборот, эффект «спасения» наблюдается лишь в условиях трансформации, которые не вызывают сайленсинга (т.е. лишь умеренные числа копий для неэкспрессируемых конструктов или любое число копий для экспрессируемых трансгенов) (Gamier et al., 2004). Таким образом, оказывается, что накопление ~23-нуклеотидных siRNA может предотвратить эффект «спасения» последовательностей гена А в материнском макронуклеусе, который стимулирует амплификацию гена А в развивающемся макронуклеусе. Это является сильным доводом в пользу того, что цитоплазматическим фактором, опосредующим транс-ядерный эффект, является транскрипт гена А. Однако это не обязательно должна быть полноразмерная mRNA, потому что даже фрагменты кодирующей последовательности обладают, как было показано, «спасающей» активностью. Более того, клоны, содержащие целый ген, часто экспрессируют эту mRNA на протяжении всего вегетативного роста, тогда как продукция «спасающего» цитоплазматического фактора ограничена, как было показано, периодом ядерной реорганизации.

Если делеция или сохранение клеточных генов контролируются путем сравнения содержания соматического генома и генома зародышевой линии, тогда даже эффективная в норме эксцизия IESs могла бы, возможно, нарушаться, когда копии присутствуют в материнском макронуклеусе. Изучение менделевской мутации, mtF E, обладающей плейотропными влияниями на развитие макронуклеуса, в том числе влиянием на детерминацию типа спаривания (Brygoo and Keller, 1981a,b), дало возможность проверить это предсказание. Оказалось, что эта мутация, будучи в гомозиготном состоянии, отменяет вырезание IES-последовательности, локализованной в гене поверхностного антигена G. Удивительно, но когда аллель дикого типа гена mtF была реинтродуцирована в мутантный штамм в результате конъюгации, эта IES все еще не вырезалась в ходе последующего развития макронуклеуса (Meyer and Keller, 1996). Генетический анализ получившегося в результате вариантного штамма, названного штамм IES 4, подтвердил, что генетически он является диким типом и что специфическое сохранение этой IES наследуется по материнской линии в половом потомстве (Duharcourt et al., 1995).

Является ли эксцизия IES в развивающихся макронуклеусах индуцированной материнскими копиями корректно перестроенного гена G или же ингибированной материнскими копиями сохраняющего IES гена G ?

Чтобы ответить на этот вопрос, макронуклеусы клеток 1ES +или IES были трансформированы с помощью прямой микроинъекции плазмид, содержащих фрагмент кодирующей последовательности G в ее микронуклеарной (IES +) или макронуклеарной (IES ) версиях (рис. 7.8) (Duharcourt et al., 1995). После автогамии трансформированные клоны, содержавшие плазмиду IES", дали линии потомков, которые сохранили IES в своих вновь сформировавшихся макронуклеусах, тогда как клетки IES +, трансформированные плазмидой IES", оказались неспособными индуцировать эксцизию, и их потомство оставалось в состоянии IES +. Плазмида, содержавшая только IES, без каких-либо фланкирующих последовательностей, также вызывала сохранение IES, показывая тем самым, что одни только материнские копии IES подавляют эксцизию из материнских макронуклеусов (Duharcourt et al., 1995).

Может ли вырезание других IESs контролироваться подобными материнскими влияниями? Для ответа на этот вопрос макронуклеусы клеток дикого типа трансформировали большими сегментами микронуклеарной ДНК (IES +), содержащими гены поверхностных антигенов либо G, либо A (Duharcourt et al., 1998). Эти инъецированные сегменты содержали, соответственно, шесть и девять IESs. Изучали эксцизию 13 из этих IESs, и оказалось, что пять IESs сохранялись в макронуклеусах поставтогамных потомков этих трансформированных клеток. Инъекция плазмид, содержащих одиночные IESs, показала, что подавление было строго специфичным: каждая из этих пять IESs индуцировала сохранение только гомологичной зиготической IES, но не влияла на какие-либо другие. Контрольный фрагмент ДНК, содержавший большую часть макронуклеарного (IES) гена (7, не оказывал никакого влияния на любую из тестируемых IESs. Среди 13 испытанных IESs Paramecium не было сколько-нибудь очевидных различий в величине, составе оснований или в положении внутри генов между этими пятью, которые продемонстрировали материнский эффект, и восьмью, которые его не обнаружили (Duharcourt et al., 1998).