Михаил Супотницкий - Биологическая война (Часть 3)

Генетически измененные штаммы и их обнаружение.При оценке микробиологическими методами свойств культуры В. anthracis, выделенной в очаге сибирской язвы, ученый вынужден учитывать ее происхождение, проведение пассажей через питательные среды и лабораторных животных. Различия по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным и вирулентным свойствам между штаммами В. anthracis. выявленные в ходе таких исследований, могут быть вызваны их естественной диссоциацией. К постепенной утрате вирулентности приводит длительное пребывание В. anthracis в почве.

Наоборот, вирулентность восстанавливается при 5—8-кратном пассировании маловирулентного В. anthracis через чувствительных животных. Наиболее часто измененные, ослабленные по вирулентности формы возбудителя сибирской язвы, выделяют из организма инфицированных свиней. В природе широко циркулируют атипичные штаммы В. anthracis, но тем не менее способные вызывать болезнь у сельскохозяйственных животных.

Лиц, стоящих за биотеррористическими преступлениями, разумеется, меньше всего интересует получение колоний В. anthracis «без завитков» и при выращивании на жидкой питательной среде, в пробирках, формирующих аморфный осадок. Их усилия по получению генетически измененных вариантов сибиреязвенного микроба будут направлены на получение высоковирулентных штаммов, резистентных к антибиотикам и способных преодолевать иммунитет, создаваемый коммерческими вакцинами. Для конструирования генетически измененных штаммов сибиреязвенного микроба используют способы генетического переноса и векторы, созданные для непатогенных бацилл. Принципиальных ограничений методического характера для их применения на В. anthracis не существует. Препятствия «экспериментаторам» в попытках повысить поражающее действие биологических агентов создает только сам микроорганизм (см. разд. 2.2.2 «Ограничения в конструировании штаммов реплицирующихся биологических поражающих агентов с измененными свойствами»),

С 1980-х гг. для В. anthracis разрабатываются способы генетического переноса плазмид, основанные на конъюгации, фаговой трансдукции и различных приемах трансформации [2] Подробнее о способах генетического переноса см. в разд. 2.2.2 «Механизмы вмешательства в геном бактерий». (табл. 3.2).

Резистентность к антибиотику | Механизм приобретения резистентности | Организация | Источник информации

К тетрациклину (рВС16) и хлорамфениколу (рС194) | Трансдукция | USAMRHD, Fort Detrick (США) | R. E. Rufel et al. (1984)

К тетрациклину (рВС16) и эритромицину (маркер плазмиды pLS20) | Конъюгацией от В. subtilis совместно с крупной плазмидой pLS20 | То же | Т. M. Koehler et al. (1987)

К тетрациклину путем мутагенеза стрептококковым транспозоном Tn916 | От Streptococcus faecalis DS16C1 к В. anthracis YNR-1 посредством конъюгации | То же | В. E. Ivins et al., (1988)

К рифампицину | Отбор сптонтанных мутантов | Институт прикладной микробиологии. г. Оболенск (Россия) | А П. Померанцев с соавт. (1993)

К пенициллину, римфипицину, тетрациклину, хлорамфениколу, макролидам и линкомицину | Трансформация рекомбинантной плазмидой рТЕС | То же | A. V. Stepanov et al. 1996)

К хлорамфениколу | Трансформация интегрирующейся в хромосому плазмидой рСЕТ | То же | А. П. Померанцев с соавт. (1996)

К канамицину | Плазмидная трансформация | Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, UK | J. E. Bowen et al. (1999)

К хинолонам | Отбор спонтанных мутантов, но возможна и плазмидная трансформация | Armed Forces Radiobiol. Res. Inst., Maryland, США | T. A. Davies et al. (2001)

К рифампицину | Индукция мутантов УФ-све-том + получение спонтанны: мутантов | Northern Arizona Univ., США | A. F. Vogler et al. (2002)

Зарубежные исследователи обычно ограничиваются сообщениями о переносе в сибиреязвенный микроб тех или иных плазмид с генами антибиотикорезистентности и не касаются вопроса влияния приобретенной антибиотикорезистентности на эффективность антибиотикотерапии сибиреязвенной инфекции. Поэтому Л. И. Марининым с соавт. (1999) были получены аналогичные трансформанты В. anthracis, и в экспериментах по лечению на животных оценена их способность вызывать инфекционный процесс. Методом серийных разведений они определили для трансформантов МПК антибиотиков тетрациклиновой группы при разных условиях культивирования. Их данные показывают, что введение в составе плазмиды рВС16 (см. рис. 2.3) гена Тс rв возбудитель сибирской язвы может в 50—100 раз повысить его устойчивость к отдельным антибиотикам из группы тетрациклицина (табл. 3.3).

| Величина МПК, мкг/см 3при разных условиях культивирования

Штамм | Антибиотик | без капсулообразования | при синтезе капсулы

Тетрациклин | 0,25 | 0.25 | 4–7

Доксициклин | 0,025 | 0,025 |

Миноциклин [3] Миноциклин — полусинтетическое производное тетрациклина. У препарата отсутствует перекрестная устойчивость с тетрациклинами. | 0,025 | 0,05 |

Тетрациклин | 128 | 128 | 4–7(dBC16)

Доксициклин | 16 | 16 |

Миноциклин | 2 | 8

В экспериментах по лечению было установлено, что среднетерапевтические дозы тетрациклина или доксициклина не предотвращают гибели золотистых хомяков, инфицированных подкожно спорами В. anthracis Ч-7(рВС16), в то время как животные, инфицированные спорами В. anthracis 4–7, выживали (Маринин Л. И. с соавт., 1999).

Предположить, что выделенные от жертв биотеррористического акта или диверсии штаммы В. anthracis являются генетически измененными, можно, сравнивая их фенотипы с фенотипами известных штаммов по маркерам, характерным для генно-инженерного конструирования возбудителей инфекционных болезней с усиленным поражающим действием (антибиотикорезистентность, факторы патогенности, токсины и т. п.). Например, штамм Ч-7(рВС16), полученный Л. И. Марининым с соавт. (1999), отличается от наиболее часто встречающихся в природе штаммов В. anthracis наличием резистентности к тетрациклину, а штамм Ч-7(рОВ12) — еще и способностью вызывать гемолиз эритроцитов (см. ниже). Получить доказательства генно-инженерного вмешательства в геном бактерии можно только молекулярно-генетическими способами — по наличию в бактериальной клетке нехарактерных для нее генетических структур или генов. Методический уровень использованных для этого способов исследования будет зависеть от технологий, с помощью которых новая генетическая информация была введена реципиенту. Бациллярные клонирующие векторы первого поколения, использованные в 1980-х гг. для конструирования генетически измененных штаммов сибиреязвенного микроба, представляли собой многокопийные автономно реплицирующиеся молекулы ДНК, не способные интегрироваться с геномом бактерии-реципиента. Независимо от способа генетического переноса обнаружить «лишнюю» плазмиду среди собственных плазмид реципиента можно по плазмидному профилю (рис. 3.8).