Чарльз Эллис - Эпигенетика

Первая, это, конечно, документирование гиперметилирования и его последствий для состояния экспрессии гена, включая способность гена подвергаться реэкспрессии при деметилировании промотора. Вторая — наличие гиперметилирования и сайленсинга данного гена должны быть хорошо установлены как в первичных пробах из опухолей, так и в культуре опухолевых клеток. Третья, как объясняется ниже, часто необходимо знать, в какой точке развития опухоли осуществляется сайленсинг гена (рис. 24.4). Четвертая — следует напрямую оценить, насколько канцерогенной является потеря функции гена. Можно начать с рутинного изучения культур клеток через оценку влияния восстановления гена на свойства клеток, такие как индукция апоптоза, эффект клонирования на мягком агаре, и влияние на канцерогенность клеток, растущих как ксенотрансплантат (гетеротрансплантат) в безтимусовых мышах. Пятая должна быть определена функция кодируемого белка либо через предварительные сведения относительно типа белка — через распознование его предполагаемых функций исходя из природы его структуры, или через изучение биологических свойств белка на моделях культур клеток. В конечном счете, однако, должен быть сделан шестой шаг, который может часто включать в себя трангенные нокаутные подходы, чтобы установить роль гена как гена-супрессора опухоли и чтобы понять, каковы функции кодируемых белков в развитии, обновлении клеток у взрослого организма и т.д. Изучение нокаутных мышей оказались чрезвычайно полезными для подтверждения функции HIC-1 как гена-супрессора опухоли, после того как он был идентифицирован посредством отбора тех участков генома раковых клеток, которые утратили гетерозиготность (W.Y. Chen et al., 2003, 2004). Эти сомнения и особенно шестой этап, показывают, насколько важно обнаружить гены, эпигенетически сайленсированные при раке, но создают широкий фронт работы, который следует рассмотреть исследователям в этой области.

1. Обосновать метилирование промотора островка CpG и скоррелировать с транскрипционным сайленсингом гена и способностью отменять сайленсинг деметилирующими препаратами в культуре клеток

2. Обосновать корреляцию гиперметилирования промотора со специфичностью к этому изменению в раковых клетках (культура клеток и первичные опухоли) против аналогов среди нормальных клеток и случаев изменения гиперметилирования в первичных опухолях

3. Обосновать положение измененного метилирования для развития опухоли рака данного типа

4. Обосновать потенциальное значение генного сайленсинга при опухолеобразовании при помощи изучения реинсерции генов в культуре клеток и влияния на клонирование на мягком агаре, при росте опухолевых клеток в голых мышиных эксплантах и т.п.

5. Установить функцию белка, кодируемого сайленсным геном — либо через известные свойства либо путем тестирования активности узнаваемых белковых мотивов в культуре и т.п.

6. Обосновать супрессорную активность и функцию гена при обновлении клетки и т.п., особенно для совершенно неизвестных генов, посредством изучения нокаутных мышей.

Согласно классическому взгляду на развитие рака, сформулированному Фогелыитейном и его коллегами (Kinzler and Vogelstein, 1997), серия генетических изменений стимулирует продвижение от ранних предмалигнизованных стадий через появление инвазивного рака к началу метастазирующей стадии заболевания (рис. 24.4). Это развитие у разных опухолей не обязательно всегда осуществляется именно в таком порядке Мы знаем, что на всем протяжении такого хода событий, также имеют место эпигенетические изменения: наблюдается раннее появление как широко распространенных утрат нормального метилирования ДНК, так и его более локального прироста в промоторах генов, которые мы обсуждаем. Таким образом, имеется потенциальная возможность для взаимодействия эпигенетических и генетических событий, чтобы направлять последовательные клеточные аномалии на всем протяжении неопластической прогрессии. В соответствии с этим сценарием, данные, касающиеся двух эпигенетических аспектов — потери импринтинга (LOI — loss of imprinting) (как это обсуждалось в главе 23) и сайленсинга генов — оказываются крайне важными для ранних стадий развития рака.

Рис. 24.4.Ранняя роль аномального метилирования ДНК в развитии опухоли

Описано в класической модели (Kinzler and Vogelstein, 1997) генетических изменений в процессе эволюции рака толстой кишки. Показано, что измененное метилирование ДНК имеет место очень рано ( красная стрелка ), как сказано в тексте, во время превращения нормального эпителия в гиперпластический. Этот факт определяет его стратегическое положение ( левая нижняя черная стрелка и левый нижний прямоугольник ): стволовые клетки направляются на путь аномальной клональной экспансии (рис. 24.5) при содействии ключевых генетических изменений. Эти эпигенетические аномалии также имеют смысл маркеров, как показано в нижнем левом черном прямоугольнике. Аномальное метилирование ДНК продолжает накапливаться в процессе превращения опухолей из неинвазивных в инвазивные и, наконец, метастазирующие ( правая нижняя стрелка и правый прямоугольник ). Это создает дополнительную основу для лечения рака и для поисков маркеров, используемых в прогнозировании заболевания

Потеря импринтинга включает в себя процесс, при котором «молчащая» аллель импринтированных генов активируется во время канцерогенеза таким образом, что устанавливается двуаллельная экспрессия гена и избыток продукта данного гена (Rainier et al., 1993). Наиболее изученный пример касается гена IGF2 в таких опухолях, как рак толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005). В этом случае гиперметилирование промотора в импринтированном гене Н19 на краю хромосомы является результатом сложного процесса контролирования хроматина (глава 19), чтобы аномально активировать «молчащую» аллель 7GF2 (Kaneda and Feinberg, 2005). Получающяяся в результате двуаллельная экспрессия IGF2 приводит к переизбытку белка TGF2, стимулирующего рост. Экспериментальные свидетельства предполагают, что это может играть роль на очень ранних стадиях образования рака толстой кишки (Kaneda and Feinberg, 2005; Sakatani et al., 2005). И действительно, недавние исследования на мышиных моделях предполагают, что сама по себе LOI может быть достаточна, чтобы инициировать процесс опухолеобразования (Holmetal., 2005).