Чарльз Эллис - Эпигенетика

Вторая группа эпигенетически сайленсированных генов — это те гены, которые, благодаря их функции, ранее были идентифицированы как кандидатуры на роль генов-супрессоров опухоли, но для них не было показана сколько-нибудь существенная частота инактивации за счет мутаций. Эти гены могут рассматриваться как потенциальные супресоры, потому что они находятся в таких позициях на хромосомах, которые при раковых заболеваниях часто подвергаются делениям (табл. 24.3). Примерами являются RASFF1A и FHIT на хромосоме Зр при раке легких и опухолях других типов (Dammann et al., 2000; Burbee et al., 2001). Остальные гены — это те, про которые известно, что они кодируют белки, содействующие функциям, существенным для предотвращения роста опухоли, такие как ген проапоптоза, DAP-киназы (Katzenellenbogen et al., 1999).

Эти гены бросают вызов всей области эпигенетики рака, поскольку, несмотря на то, что при опухолях в них обнаружено частое гиперметилирование промотора должно быть специально доказано (поскольку многие из этих генов часто, если не всегда, мутируют) каким именно образом эти гены участвуют в генезе опухоли. Мы вернемся к этому вопросу в дальнейшем.

Третья группа генов идентифицируется по стратегиям, применяемым для случайной идентификации аберрантно сайленсированных генов, ассоциированных с гиперметилированием промотора (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). По сравнению с генами из второй группы, трудно поместить их в функциональный контекст развития рака, поскольку их функции могут быть совершенно неизвестны.

Чаще всего используемый подход при идентификации новых генов, эпигенетически сайленсированных при раке, заключается в том, чтобы рассматривать в качестве кандидата любой потенциальный ген-супрессор опухоли, если мутации не обнаружены, или если экспрессия гена в изучаемых опухолях низкая, или вообще отсутствует. Другой используемый подход — это применить технику случайного скриннинга раковых геномов на гиперметилированные гены (Toyota et al., 1999; Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002; Ushijima, 2005). Этот путь предоставляет огромные возможности для обогащения наших знаний в области биологии рака, но также вызывает много проблем. Как недавно было сказано в обзоре (Ushijima, 2005), каждый подход имеет свои сильные и слабые стороны.

Несколько подходов зависят от первого этапа, когда ДНК переваривается одним или несколькими рестрикционными ферментами, которые дифференциально расщепляют сайты CpG, в зависимости от того, метилированы ли они. Затем, чтобы определить потенциально гиперметилированные гены, продукты анализируют при помощи двухмерного электрофореза (Restriction Landmark Genomic Sequencing, RLGS), случайно амплифицируют, применяя случайные праймеры, или технику вычитания, чтобы дифференцировать метилированные последовательности нуклеотидов нормальной ДНК и ДНК из опухоли. Эти методы способны идентифицировать большое количество гиперметилированных генов, и каждый из них добавляет новые сведения относительно важных потенциальных кандидатов на роль генов-супрессоров опухоли. Однако идентифицированные последовательности нуклеотидов могут быть либо связаны, либо на связаны с островками CpG, которые стратегически расположены так, чтобы участвовать в сайленсинге генов. Повторяющиеся последовательности, которые часто бывают высокометилированными, иногда включены в конечные продукты. В результате, эффективность идентификации гиперметилированных генов-супрессоров опухоли часто бывает не очень высока и затруднительна в масштабах целого генома.

Другие подходы связаны с опознаванием на микрочипах нуклеотидных последовательностей содержащихся в геноме островков CpG (С.М. Chen et al., 2003), поскольку они часто связаны со стартовыми сайтами гена, и с зондированием чипов с помощью геномной ДНК, которая была переварена чувствительными к метилированию ферментами, либо с помощью кДНК, с учетом статуса экспресии генов. Этот подход обладает мощным потенциалом для идентификации гиперметилированных супрессоров опухоли, но он ограничен числом возможных островков CpG, которые могут быть чипированы.

Еще один подход состоит в том, чтобы обрабатывать культуры опухолевых клеток агентами, которые вызывают деметилирование ДНК, такими как 5-азацитидин или 5-аза-2’-деоксицитидин, и проводить гибридизацию РНК до и после обработки препаратами на генных микрочипах для выявления ап-регурированных генов (Suzuki et al., 2002; Yamashita et al., 2002). Этот подход потенциально может идентифицировать все гиперметилированные гены в культурах клеток всех типов человеческого рака. Однако изменения в генах, вызванные другими причинами, нежели деметилируюшая активность используемых препаратов, может понизить эффективность идентификации гиперметилированных генов. Меньше всего осознается тот факт, что самый низкий уровень экспрессии разыскиваемых генов, как до, так и после обработки препаратами резко ставит под вопрос чувствительность большинства генов микрочипов, заметно снижая эффективность данного подхода (Suzuki et al., 2002). Применение метода вычитания после обработки препаратами для обогащения генными транскриптами, содержание которых повышено, может повысить чувствительность подхода, основанного на генных микрочипах (Suzuki et al., 2002), но он должен быть адаптирован таким образом, чтобы удовлетворять требованиям флуоресцентного мечения зондов для микрочипов, что легко позволит покрыть весь геном Одновременное применение препаратов, модифицирующих изменения хроматина, которые действуют совместно с метилированием промотора ДНК, например, такими как ингибиторы HDAC, может помочь в подходах, основанных на генных микрочипах. Данный маневр помогает более специфично идентифицировать разыскиваемые гены, принимая во внимание ту роль, которую изменения хроматина играют в сайленсировании гиперметилированных генов, что детально обсуждается в последующем разделе. Этот последний подход позволил недавно идентифицировать важные гены, сайленсированнные при раке толстой кишки (Suzuki et al., 2002).

Стремительность, с которой стали обнаруживаться гиперметилированные гены при раке, представляет собой исследовательскую проблему, вызывающую опасения. Частое гиперметилирование промотора данного гена не гарантирует само по себе функционального значения для сайленсинга сопутствующего гена, что обычно бывает при потере функции, обусловленной генетической мутацией. Это имеет место особенно в том случае, когда гиперметилированный ген не является известным классическим супрессором опухоли и когда нет свидетельста тому, что этот ген также может часто мутировать при различных видах рака. Итак, обязательно, чтобы рассматриваемый ген изучался таким образом, чтобы важность потери функции определялась и с точки зрения процессов, контролируемых кодируемым белком, и с точки зрения последствий этого для развития опухоли. Есть несколько возрастающих по значению стадий таких исследований, очерченных в табл. 24.4; целью этих исследований является строгое документирование роли в образовании раковых заболеваний.