Чарльз Эллис - Эпигенетика

Вместе с описанными генетическими подходами к протеазо-дефицитным штаммам, растущим в синхронных и асинхронных крупномасштабных культурах, вполне применимы биохимические методы. В последние годы арсенал доступных средств расширился изощренными методами анализа с помощью микрочипов и белковых сетей, легко охватывающих весь небольшой геном дрожжей. Эти методы позволяют осуществлять полногеномный анализ транскрипции, связывания факторов транскрипции, модификации гистонов и белок-белковых взаимодействий. Этот широкий арсенал изощренных методов позволил ученым исследовать механизмы регуляции формирования гетерохроматина и его физиологическую роль в клетках дрожжей. Однако, прежде чем описать эти открытия, необходимо более детально рассмотреть жизненный цикл дрожжей.

Дрожжи S. cerevisiae размножаются путем митотических делений в гаплоидном или диплоидном состоянии, образуя почку, которая постепенно увеличивается и в какой-то момент отделяется от материнской клетки (рис. 4.2а). Гаплоидные клетки дрожжей могут спариваться друг с другом (коньюгировать), поскольку существуют в виде одного из двух типов спаривания, обозначаемых как а и а, напоминающих два пола у млекопитающих. Клетки каждого типа образуют свой феромон, привлекающий клетки противоположного типа: клетки типа а синтезируют 12-членный пептид, называемый а-фактор, который связывается мембранным рецептором а-фактора на поверхности клеток типа α. И наоборот, клетки типа а синтезируют 13-членный пептид. который связывается рецептором α-фактора на поверхности клеток типа а. Эти взаимодействия приводят к остановке клеток на стадии от средней до поздней G 1-фазы клеточного цикла. При этом клетки приобретают грушевидную форму, называемую «шму» (shmoo) по имени персонажа известного мультфильма (рис. 4.2б). Клетки противоположных типов сливаются своими выпячиваниями, образуя диплоидную клетку а/а. В диплоидных клетках способность к спариванию репрессирована: они размножаются вегетативно (т.е. путем митотических делений), как и гаплоидные клетки. С другой стороны, в условиях голодания в них индуцируется мейотическая программа, приводящая к формированию аска (сумки) с четырьмя спорами, по две каждого типа спаривания. При поступлении достаточного количества питательных веществ гаплоидные споры превращаются в клетки, способные к спариванию, т.е. возобновляется нормальный жизненный цикл.

Рис. 4.2.Жизненный цикл почкующихся дрожжей

(а)Клетки дрожжей митотически делятся в гаплоидной и диплоидной формах. Голодание индуцирует споруляцию диплоидных клеток, а при сближении гаплоидных клеток противоположных типов происходят спонтанные скрещивания. Это является результатом секреции феромонов, вызывающих в клетке противоположного типа остановку клеточного цикла на стадии G1 и, после достаточно продолжительного действия феромона. — индукцию пути спаривания. Диплоидное состояние репрессирует путь спаривания.

(б)В ответ на действие феромона гаплоидные клетки «выпячиваются» по направлению клеток противоположного типа Получающаяся форма называется «шму» (по имени известного мультипликационного персонажа) Ядерная оболочка видна как флюоресценция зеленого цвета

Хотя в лабораторных условиях гаплоидные клетки дрожжей обычно маркируются одним из двух типов спаривания, в естественных условиях они переключают свои тип спаривания практически с каждым клеточным циклом (рис. 4.3а). Такое переключение индуцируется эндонуклеазной активностью (НО), осуществляющей сайт-специфический двунитчатый разрыв в области локуса МАТ. Происходящий затем процесс конверсии генов переносит информацию о противоположном типе спаривания из конститутивно «молчащего» донорского локуса НМLa или HMR α , в активный локус МАТ. Такие штаммы называют гомоталлическими (homothallic). Это означает, что вегетативно растущая клетка типа МАТа быстро даст МАТ α потомство и наоборот. В условиях лаборатории удобно использовать клетки со стабильным типом спаривания, поэтому лабораторные штаммы конструируют с дефектным геном эндонуклеазы НО, что исключает расщепления локуса МАТ и. соответственно, переключение типов спаривания. В результате образуется гетероталлический штамм. Такие штаммы содержат «молчащие» локусы НМ и активный локус МАТ стабильно а-или α-типа. Два «молчащих» локуса типов спаривания (рис. 4.3б), по одному для каждого «пола», поддерживаются в конститутивно «молчащем» эпигенетическом состоянии и стали классической моделью для изучения гетерохроматина.

У дрожжей информация, детерминирующая типы спаривания (а или а), находится в трех локусах, НМ La, МАТ, и HMRa, III хромосомы. Локусы HML α (~11 т.п.н. от левой теломеры) и HMR a(-23 т.п.н. от правой теломеры; рис. 4.36,в) расположены между короткими элементами ДНК, называемыми сайленсерами Е и I. Только когда любая из двух «молчащих» кассет копируется и интегрируется в активный локус МАТ, она приобретает способность транскрибироваться в нормальной клетке. Перенос информации из локуса HML α в локус МАТ приводит к образованию клетки с типом спаривания α (МАТ α ), а перенос информации из локуса HMR aв локус МАТ — клетки типа а (МАТ а ) (рис. 4.36). Это показывает, что гены и промоторы в локусах ЯМ невредимы, но находятся в стабильно репрессированном состоянии до тех пор, пока остаются в этих локусах. Это — существенное для поддержания способности к скрещиванию обстоятельство, поскольку одновременная экспрессия в одной и той же клетке транскриптов обоих типов ( аи α) приводит к возникновению не способного к скрещиванию стерильного состояния. Регистрация стерильного фенотипа оказалась весьма полезной для идентификации мутаций, нарушающих сайленсинг локусов НМ. Белки-регуляторы сайленсинга (silent information regulatory proteins — SIRs) SIR1, SIR2, SIR3 и SIR4 были обнаружены именно как необходимые для полной репрессии «молчащих» локусов НМ ( см. обзор Rusche et al., 2003). Мутации sir2, sir3, и sir4 приводят к полной утрате сайленсинга, в то время как при мутациях sirl лишь часть клеток МАТ аутрачивает способность к спариванию из-за нарушения репрессии локуса НМ. Благодаря частичному фенотипу sirl- дефектных клеток удалось показать, что альтернативные состояния (спаривающееся-неспаривающееся) могут наследоваться в последовательных поколениях делящихся генетически идентичных клеток (Pillus and Rine 1989). Это послужило ясной демонстрацией того, что репрессия типов спаривания обладает характерными чертами эпигенетически контролируемого процесса. Кроме того, в других исследованиях было показано, что в образовании структуры гетерохроматина участвуют N-концевые участки молекул гистонов H3 и Н4, белок-активатор репрессора 1 (repressor activator protein 1 - Rap1) и комплекс узнавания ориджинов репликации (origin recognition complex — ORC) (см. обзор Rusche et al., 2003).