Е. Бессолицына - Биохимия метаболизма. Учебное пособие

Среди простых соединений самым «смертельным» ядом является фторацетат натрия. LD 50(доза, летальная для 50% получивших ее животных) для крыс составляет всего лишь 0,2 мг/кг – почти в 10 раз меньше летальной дозы нервного яда диизопропилфторфосфата. Широко употребляемый (хотя и отзывы о его действии противоречивы) как яд для грызунов «1080», фторацетат был также обнаружен в листьях некоторых ядовитых растений, встречающихся в Африке, Австралии и Южной Америке. Примечательно, что дифторацетат НСР 2—СОО -вообще нетоксичен. Биохимическими исследованиями установлено, что сам фторацетат не оказывает на клетки токсического действия. Токсичность проявляется лишь после метаболического превращения фторацетата в фтороцитрат, являющийся высокоспецифичным ингибитором аконитазы. Этот факт весьма примечателен, поскольку изомерный фторцитрат, образующийся в реакции фтороксалоацетата с ацетил-СоА, оказывает на тот же фермент лишь слабое ингибирующее действие, хотя как раз у этого изомера атом фтора находится на том участке, который атакуется аконитазой. Атом фтора имеет небольшой ван-дер-ваальсов радиус (0,135 нм), сравнимый с ван-дер-ваальсовым радиусом водорода (0,12 нм); на это обстоятельство часто ссылаются, когда говорят о способности фторсодержащих соединений «обманывать» ферменты. Однако более вероятно, что высокая электроотрицательность фтора и его способность к участию в водородных связях делают его в метаболическом отношении более сравнимым с – ОН-группой. В случае с фторцитратом предполагают, что ингибирующий изомер связывается с аконитазой «неправильным способом», при котором атом фтора оказывается координационно-связанным с атомом железа в активном центре аконитазы.

Эксперименты с использованием промежуточных соединений, меченных изотопом С 14, показывают, что аконитаза взаимодействует с цитратом асимметрично: она всегда действует на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоацетата. Это сначала было трудно объяснить, так как лимонная кислота является внешне симметричным соединением. Однако положение в пространстве двух групп – СН-СООН лимонной кислоты относительно групп – ОН и – СООН неидентично. Об асимметричном действии аконитазы свидетельствует «судьбах меченого ацетил-СоА (т. е. положение атомов С 14) в интермедиатах цикла лимонной кислоты. Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пути.

Образовавшийся изоцитрат окисляется под действием изоцитратдегидрогеназыдо оксалосукцината или α-кетоглутарата. Окислению подвергается гидроксильная группа изоцитрата, образующаяся в результате кето-группа дестабилизирует карбоксильную группу во втором положении, это приводит к декарбоксилированию. Карбоксильная группа отщепляется в виде молекулы углекислого газа. Это первая молекула СО 2, образующаяся при окислении ацетил-СоА. Важным компонентом реакции декарбоксилирования являются ионы Мn 2+(или Mg 2+). Акцептором протонов и электронов является молекула NAD +, в результате образуется NADH. Описаны три различных формы изоцитратдегидрогеназы. Одна из них, NAD + -зависимая,найдена только в митохондриях. Две другие формы фермента являются NADP +-зависимыми, причем одна из них также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата, связанное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно NAD +-зависимым ферментом.

Образовавшийся в результате окисления изоцитрата α-кетоглутарат подвергается окислительному декарбоксилированию,сходному с окислительным декарбоксилированием пирувата. Окислительное декарбоксилирование α-кетоглутарата катализируется α-кетоглутарат-дегидрогеназным комплексом, сходным по структуре с пируват-дегидрогеназным комплексом. В состав α-кетоглутарат-дегидрогеназного комплекса входят три вида ферментов: α-кетоглутарат-дегидрогеназный, транссукцинилазный и дигидролипоил-дегидрогеназный компоненты. Ядро комплекса составляет транссукцинилаза (аналогично трансацетилазе). α-Кетоглутарат – дегидрогеназный компонент и транссукцинилаза отличаются от соответствующих ферментов пируват-дегидрогеназного комплекса. В то же время дигидролипоил-дегидрогеназные части обоих комплексов идентичны. Видно, что пируват- и α-кетоглутарат-дегидрогеназные комплексы представляют собою гомологичные ассоциации ферментов. Структурные и механистические особенности, обеспечивающие координированный катализ на входе в цикл трикарбоновых кислот, вновь используются позднее в процессе функционирования этого цикла. Равновесие реакции настолько сильно сдвинуто в сторону образования сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приводит к накоплению субстрата (α-кетоглутарата). Реакция окисления α-кетоглутарата с образованием сукцинил-СоА является реакцией окислительного декарбоксилирования с образованием параллельно молекул СО 2и NADH. Это последняя реакция первого этапа цикла.

Все последующие реакции относятся ко второму этапу цикла – регенерации оксалоацетата.

Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат, катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой).Одним из субстратов реакций является ГДФ (или ИДФ), из которого в присутствии неорганического фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это – единственная стадия цикла лимонной кислоты, в ходе которой генерируется высокоэнергетическая фосфатная связь на субстратном уровне; при окислительном декарбоксилировании α-кетоглутарата потенциальное количество свободной энергии достаточно для образования NADH и высокоэнергетической фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может образовываться как из ГТФ, так и из ИТФ.

Сукцинаттиокиназа – фермент, располагающийся в печени. В альтернативной реакции протекающей во всех других тканях кроме печени и катализируемой сукцинилСоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой(тиофоразой), сукцинил-СоА превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в ацетоацетил-СоА. В данной реакции нуклеозидтрифосфаты не образуются, но эта реакция используется для активации ацето-ацетата, что важно для обмена липидов, который будет подробно рассмотрен ниже.

Далее сукцинат дегидрогенируется с образованием фумарата. Дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой, связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны. Это единственная дегидрогеназная реакция цикла лимонной кислоты, в ходе которой осуществляется прямой перенос водорода с субстрата на флавопротеин без участия NAD +. Фермент содержит FAD +и железо-серный (Fe-S) белок. В рзультате окисления сукцината до фумарата образуется FADH 2. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует сукцинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината.