Чарльз Эллис - Эпигенетика

Результаты, наблюдаемые по перестройкам хромосом, заставляют предполагать, что эухроматиновый ген, в результате транспозиции вставленный в гетерохроматиновый район, также будет обнаруживать мозаичный фенотип. Так оно и оказалось. Для этой цели можно подвергнуть генноинженным манипуляциям Р-элемент — ДНК-транспозон, обнаруживамый во многих природных линиях Drosophila. Природный P-элемент имеет на каждом конце особые инвертированные повторяющиеся последовательностиикодируетвсеголишьодинфермент— P-специфическую ДНК-транспозазу Репортерные конструкты, лишенные ДНК-транспозазы, но содержащие другие гены, представляющие интерес для исследователя, можно вставить в геном Drosophila в присутствии активной транспозазы путем их совместной инъекции в эмбрионы Drosophila. Мобильный элемент на основе Р (такой, как показано на рис. 5.3а), несущий управляемую hsp70 копию white, можно использовать в мухах, лишенных эндогенной копии white, чтобы идентифицировать домены гетерохроматина Когда P -элемент вставляется в эухроматин, муха имеет красные глаза. Когда же этот Р мобилизуется (путем встраивания в ген, кодирующий транспозазу), приблизительно 1 % выявляемых линий обнаруживают мозаичный фенотип глаз. Гибридизация in situ показывает, что в этих случаях P-элемент перескочил в перицентромерный гетерохроматин, теломеры или небольшую четвертую хромосому (Wallrath and Elgin, 1995). Эта идентификация гетерохроматиновых доменов согласуется с более ранними цитологическими исследованиями.

Рис. 5.2.Зависимые от дозы эффекты некоторых модификаторов PEV

Полагают, что модификаторы PEV, обнаруживающие зависимый от дозы эффект, являются структурными белками гетерохроматина. В то время как в присутствии двух копий гена-модификатора дикого типа наблюдается мозаичный фенотип (обнаруживаемый здесь репортерным геном white ; средняя хромосома, средний глаз мухи), присутствие трех копий гена-модификатора дикого типа обычно обусловливает более экстенсивное формирование гетерохроматина, что приводит к усилению сайленсинга репортерного гена (нижняя хромосома, нижний глаз мухи). Наоборот, присутствие только одной копии гена-модификатора дикого типа обычно приводит к пониженному формированию гетерохроматина и к повышенной экспрессии репортерного гена (верхняя хромосома, верхний глаз мухи)

Использование таких P -элементов позволило сравнить упаковку одного и того же репортерного гена в гетерохроматиновом и эухроматиновом окружении. Гетерохроматин относительно устойчив к расщеплению нуклеазами, как неспецифическими (например, ДНКаза 1), так и специфическими (рестрикционные энзимы), и менее доступен для других экзогенных зондов, таких как метилтрансфераза dam. Анализ одного и того же трансгена hsp26 (маркированного фрагментом уникальной растительной ДНК, рис. 5.3а) в эухроматине и в перицентромерном гетерохроматине с использованием микрококковой нуклеазы (MNase) выявил сдвиг в сторону более упорядоченного расположения нуклеосом в гетерохроматине (рис. 5.36, в). Фрагменты, полученные путем расщепления ферментом MNase, четко определены, что позволяет предполагать наличие меньшей, чем обычно, мишени для MNase в линкерном районе. Упорядоченное расположение нуклеосом простирается на весь 5’-регуляторный район гена; этот сдвиг несомненно обусловливает наблюдаемую потерю 5’-гиперчувствительных (HS) сайтов (Sun et al., 2001). Действительно, хотя механизм сайленсинга понят еще не полностью, имеются многочисленные данные о транскрипционной репрессии сильно мозаичных генов, включая утрату связывания TFIID и других транскрипционных факторов (Cryderman et al., 1999b).

PEV можно модифицировать различными факторами. Температура во время развития и количество гетерохроматина в геноме были первыми факторами, влияющими, как было показано, на степень мозаицизма. Как правило, повышение температуры во время развития (с 25 до 29°С) приводит к супрессии мозаицизма (утрате сайленсинга), тогда как более низкие температуры (например, 18°С) вызывают усиление мозаицизма (увеличение сайленсинга). Другие изменения в условиях культивирования, ускоряющие или замедляющие скорость развития, могут давать похожие эффекты. Сильная супрессия обнаруживается у мух, несущих дополнительную Y-хромосому (самки XXY и самцы XYY), тогда как у самцов без Y-хромосомы (Х0) обнаруживается значительное усиление. В целом дупликация гетерохроматинового материала подавляет, а делециии гетерохроматинового материала усиливают мозаицизм. Эти эффекты могут быть обусловлены титрованием фиксированного количества ключевых белков, необходимых для упаковки гетерохроматина. Первые мутации во втором сайте, супрессирующие или усиливающие PEV, были идентифицированы Шульцем (Schultz, 1950) и Споффордом (Spofford, 1967). В настоящее время приблизительно 150 генов предположительно рассматриваются как модификаторы локусов PEV.

Рис. 5.3.Гетерохроматин упакован в регулярный нуклеосомный порядок

Мобильный элемент (а), несущий маркированную копию гена теплового шока для исследования и hsp70-управляемую копию white в качестве визуального маркера, можно использовать для изучения одного и того же гена в разных хроматиновых доменах. Ядра эмбрионов Drosophila из линии, несущей этот трансген в эухроматиновом домене (39С-Х; красные глаза), и из линии, несущей тот же самый трансген в гетерохроматиновом домене (HS-2; мозаичный глаз), были переварены возрастающими количествами фермента MNase, ДНК очистили и разогнали в агарозном геле, а Саузерн-блот гибридизировали с зондом, уникальным для трансгена (б) . Линкерные сайты, расщепленные MNase, отмечены стрелками, (в) Сравниваются денситограммы последней дорожки каждой пробы ( сверху вниз — слева направо ). В гетерохроматине можно видеть набор 9—10 нуклеосом ( красная линия ) по сравнению с 5—6 нуклеосомами в эухроматине ( синяя линия ), что показывает наличие более регулярного «шага» в первом случае, (г) Схематическое представление этих результатов ( б, в — с любезного разрешения из Sun et al., 2001, с изменениями [©American Society for Microbiology])

Мутации Su(var) и E(var) идентифицируют гены, причинно связанные с началом сайленсинга гетерохроматиновых генов при PEV [with the onset of hetero-chromatic gene silencing in PEV]. Молекулярный анализ этих генов сыграл существенную роль в углублении понимания механизмов, приводящих к формированию гетерохроматина и сайленсингу генов. В большинстве случаев модифицирующее влияние мутаций на PEV является доминантным, и гетерозиготы Su(var)/+ или E(var)/+ демонстрируют фенотип с подавленным или усиленным PEV (рис. 5.1). Эффективное выделение и детальный генетический анализ мутаций Su(var) и E(var) зависят от наличия подходящей для эксперимента PEV-перестройки. Хотя было описано большое число PEV-перестроек (Flybase, 2005), лишь немногими из них можно легко воспользоваться для эффективного генетического скрининга и изоляции доминантных мутаций-модификаторов. Одна из наиболее полезных для такой экспериментальной работы PEV-перестроек— In(1)w m4 (Muller 1930). Эта перестройка обусловливает мозаицизм по white — фенотип, легко различимый на глазах взрослых мух, как показано на рис.5.1. Пенетрантность мозаицизма по white у w m4 является 100 %-ной, так что каждая муха в исходном штамме [the starting stock] имеет глаза с белой пятнистостью. Инактивация гена white не влияет на жизнеспособность или фертильность, что обусловливает возможность неограниченной работы с мухами, гомозиготными по w m4.