Дмитрий Львов - Лихорадка Западного Нила

■ определение вирусных антигенов методами прямой и непрямой иммунофлюоресценции.

■ использование моноклональных антител для идентификации новых вирусных изолятов.

■ использование иммуноферментного метода – реакции энзим–меченых антител (РЭМА) и радиоиммунного анализа (РИА).

■ применение биохимического анализа вирусных белков и нуклеиновых кислот, именно: электрофореза в полиакриламидном геле и олигонуклеотидного картирования.

Выделение вируса проводится путем ведения инокулята мышам и членистоногим и заражения клеточных линий членистоногих, таких, как культуры клеток Aedes albopictus (С6/36) или Aedes pseudoscutiflaris (АР – 61), а также линий клеток позвоночных Vero, CW.

Выделенный вирус идентифицируют, используя ряд методов:

■ способность вируса проходить через фильтры.

■ электронную микроскопию.

■ чувствительность к обработке жирорастворителями (эфиром и хлороформом).

В последние годы особое значение стали приобретать ускоренные методы диагностики вирусных инфекций. Ускоренная остановка диагноза особенно важна в случае арбовирусов и вирусов, передаваемых грызунами, в связи со многими опасными для жизни заболеваниями этой категории (как например, желтая лихорадка, геморрагическая лихорадка Денге, энцефалиты и лихорадка Ласса), а также в связи с быстрым распространением возбудителей переносчиками.

При получении ответа из вирусологической лаборатории уточняется диагноз, в случае положительного – устанавливается диагноз «лихорадка Западного Нила, клинический вариант, тяжесть течения».

При этом в территориальный ЦГСЭН подается экстренное извещение по следующим шифрам:

■ серозный менингит вирусной этиологии неуточненный (шифр МКБ 10 – А87.9).

■ серозный энцефалит вирусной этиологии неуточненный (шифр МКБ 10 – А86).

■ вирусная инфекция неуточненная (шифр МКБ 10 – В34.9).

■ лихорадка Западного Нила (ЛЗН), серозный менингит (шифр МКБ 10 – А92.3).

Дифференциальную диагностику следует проводить с другими арбовирусными инфекциями, микоплазмозом, орнитозом, лептоспирозом, хантавирусными инфекциями, Крымской геморрагической лихорадкой, листериозом, токсоплазмозом, туберкулезом, риккетсиозом, сифилисом, гриппом и другими острыми респираторными заболеваниями, энтеровирусной инфекцией, острым лимфоцитарным хориоменингитом [19, 32, 34, 35, 40, 45, 51, 66, 102, 121].

В обобщенном виде критерии диагностики представлены в табл. 5.

Моделирование лихорадки Западного Нила (ЛЗН) воспроизводилось в лаборатории арбовирусных инфекций в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского. Мыши были заражены вирусом ЛЗН (штамм 986) внутрибрюшинно по 0,3 ми. Животных под эфирным наркозом забивали: через 3–4 суток в инкубационный период (1–я группа); через 5–6 суток – погибших при развитии клинических симптомов (2–я группа); на 7–8–е сутки – с выраженными клиническими симптомами, но летального исхода не отмечалось (3–я группа); на 11–16–е сутки – без клинических симптомов (4–я группа). В качестве контроля служили интактные животные.

Материал – головной мозг, спинной мозг, сердце, легкие, органы иммунной системы, печень, желудочно–кишечный тракт, поджелудочные железы – фиксировали в 10% нейтральном формалине, жидкости Карнуа, жидкости Буэна. Микропрепараты окрашивали (в зависимости от органа) гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, по Нисслю, по Браше и Фёльгену (ДНК и РНК), азуром и эозином, суданом III–IV, по Маллори. Иммуногистохимически определяли экспрессию антигена вируса ЛЗН методом двойных антител, проводили иммуногистохимическую идентификацию Т– и В–лимфоцитов (использование стандартных систем на В–лимфоциты – CD 20, CD 26, на Т–лимфоциты – CD 46).

Инкубационный период (1–я группа) – 4–5–е сутки. Во всех отделах головного мозга отмечались явления полнокровия сосудов микроциркуляторного русла, незначительный перицеллюлярный отек Обращает на себя внимание выраженный перицеллюлярный отек в области перивентрикулярной зоны третьего желудочка головного мозга и выраженная вакуолизация нейронов. Наибольшие изменения обнаружены в гипоталамической области: повышение функциональной активности нейронов супраоптического и паравентрикулярного ядер. При постановке иммуногистохимической реакции на обнаружение антигена вируса ЛЗН был получен отрицательный результат.

У животных 2–й группы (погибшие в разгар заболевания, на 5–6–е сутки) обнаруживались более глубокие дистрофические изменения в нейронах коры головного мозга (3–4–й слой), в ядерных образованиях стриопаллидарной системы, медиальных и латеральных отделах таламуса, в ядрах миндалевидного комплекса. Дистрофические изменения (гиперхроматоз, тигролиз, вакуолизация) носили очаговый характер. В крупноклеточных ядрах гипоталамуса отмечалось выраженное функциональное истощение. Дистрофические изменения обнаруживались также в грушевидных клетках мозжечка.

Наибольший интерес представляю изменения в ядерных образованиях про долговатого мозга: распад нейронов, выраженная нейронофагия, скопление лимфоглиальных элементов по ходу сосудов сраженный отек, очаговый распад миелиновых волокон. Иммуногистохимическая реакция на антиген ЛЗН была позитивной в нейронах перивентрикулярной зоны, грушевидных клетках мозжечка и особенно в нейронах продолговатого мозга. Положительная реакция определялась также в эндо– и субэндотелиальных отделах микроциркуляторного русла головного мозга.

У животных 3–й группы (7–8–е сутки) с выраженными клиническими симптомами, о без летального исхода, выявились незначительные и умеренные очаговые дистрофические изменения в коре, подкорковых ядрах, гипоталамусе, В отделах продолговатого мозга дистрофические изменения были более выражены, однако по сравнению с животными 2–й группы носили очаговый характер.

У животных 4–й группы обнаруживались минимальные изменения, чаще носящие очаговый характер, однако в крупноклеточных ядрах гипоталамуса превалировав явления повышенной функциональной активности.

У животных 3–4–й группы иммуногистохимическая реакция на антиген ЛЗН была незначительной и в основном определялась в нейронах продолговатого мозга.

Таким образом, во–первых: характер морфологических изменений в головном мозге (менингоэнцефалит с преимущественным поражением отделов продолговатого мозга) позволяет считать внутрибрюшинное введение вируса ЛЗН адекватной моделью. Во–вторых, в развитии болезни, по–видимому, большое значение принадлежит состоянию гематоэнцефалического барьера, особенно его перивентрикулярного отдела, а также состоянию гипоталамической области. Известно, что нервная и иммунная системы, помимо осуществления своих специфических функций, выполняют в комплексе с эндокринной системой общую функцию сохранения гомеостаза. Ключевым звеном аппарата нервной регуляции иммунной системы является гипоталамус, участвующий выработке адренокортикотропного горюна, обладающего общеизвестным влиянием на развитие воспаления.